佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細胞的原代培養(yǎng)及分泌功能研究

1、    佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細胞的原代培養(yǎng)及分泌功能研究         摘要：分離、培養(yǎng)佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細胞，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，檢測細胞增殖能力及培養(yǎng)上清中白細胞介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF-)的生物活性和前列腺素E2(PGE2)的含量。結(jié)果表明 AA 大鼠滑膜細胞存在三種不同的形態(tài)，即巨噬細胞樣細胞(MCs)、樹突狀細胞(DCs)、成纖維細胞樣細胞(FCs)；滑膜細胞增殖能力增強；其分泌IL-1、TNF-和PGE2 的能力增強。本實

2、驗為研究類風濕性關(guān)節(jié)炎的病理及篩選抗風濕藥提供了理想的實驗材料。主題詞：關(guān)節(jié)炎，類風濕/病理學(xué)；關(guān)節(jié)炎，佐劑性/病理學(xué)；滑膜/分泌；白細胞介素1；腫瘤壞死因子；前列腺素；疾病模型，動物中分類號：R593.22文獻標識碼：A文章編號：1007-3213(1999)01-0060-04Primary Culure of Synoviocytes of Rats with Adjuvant Arthritis and Its Secretory FunctionSHEN Xiao-yan(advisor:CHEN Ji-fan)(Postgraduate Class of Grade 96,Guan

3、gzhou University of TCM, Guangzhou 510405,ChinaMA Wei(GLP Center, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405,China)ZHAO Hui-fang(The First Affiliated Hospital, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405,China)Abstract:Synoviocytes collected from rats with adjuvant arthritis were cultured in vi

4、tro and subjected to invented phase-contrast microscopic observation.The cell proliferation and interleukin-1(IL-1),tumor necrosis factor (TNF-)bioactivity and prostaglandin E2(PGE2) content of the supernatant fluid were assayed .The results showed that three types of synoviocytes were discerned, i.

5、e., macrophage-like cells, dendritic cells and fibroblast-like cells. The proliferation of synoviocytes was increased and the secretion of IL-1, TNF- and PGE2 was enhanced. It is concluded that this culture may provide a valuable material for pathological study of rheumatoid arthritis and the screen

6、ing of antirheumatic drugs. Key words:ARTHRITIS,RHEUMATOID/pathology;ARTHRITIS,ADJUVANT/pathology;SYNOVIAL MEMBRANE/secretion;INTERLEUKIN-1;TUMOR NECROSIS FACTOR;PROSTAGLANDINS;DISEASE MODELS, ANIMAL大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)是人類類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis ,RA)的動物模型之一，體外培養(yǎng)、檢測 AA 大鼠滑膜細胞分泌功能，從分子細

7、胞水平深入研究 AA 的發(fā)病機制及在此模型上進行各種治療性實驗，對進一步揭示 RA 的病變機理和抗風濕藥的作用機理，尋找有效的 RA 防治措施具有重要意義。1材料和方法1.1動物及細胞株清潔級 Sprague-Dawley 大鼠，雄性，23月齡，體重(180±20)g；C57BL/6，雌性，46周齡，體重(18±2)g，中山醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。L929細胞株從第一軍醫(yī)大學(xué)附屬珠江醫(yī)院血液科引進。1.2主要試劑和儀器型膠原酶、脂多糖、ConA 及放線菌素，Sigma 公司產(chǎn)品；胰蛋白酶(1250)，Difco 產(chǎn)品進口分裝；完全佛氏佐劑，日本三光株式會社產(chǎn)品；3H前列腺

8、素 E2 放免藥盒，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所藥理室提供。DMEM 培養(yǎng)粉，Gibico 公司產(chǎn)品，應(yīng)用液另加 25 mmol/L Hepes、1 mmol/L 丙酮酸鈉、2 mmol/L 谷氨酰胺、50 mol/L二巰基乙醇、 10×104 U/L青霉素、100 mg/L 鏈霉素和 15% 小牛血清，pH 調(diào)整至 7.2。CO2 培養(yǎng)箱，HWO301 T-VBA 型，美國 HARRIS 產(chǎn)品；酶標儀，3550 型，美國 BIO-RAD 公司產(chǎn)品。1.3AA 大鼠模型的建立和滑膜組織的取材SD 大鼠 12 只隨機分為模型組、正常組，每組各 6 只，模型組用完全佛氏佐劑于大鼠右后肢足跖皮內(nèi)注

9、射0.1 mL，造模后 24 d 將大鼠放血處死，置于 0.1% 新潔爾滅液中浸泡 15 min，固定，打開關(guān)節(jié)腔，分離關(guān)節(jié)囊滑膜層和纖維層，取出滑膜組織。將滑膜組織作病理切片和 HE 染色進行鑒定。1.4滑膜細胞的分離和培養(yǎng)參照王斌方法1作如下改進：(1)將分離的滑膜組織用含青霉素 200 kU/L、鏈霉素 200 mg/L 的 D-Hank's 液漂洗 3 次以減少污染機會；(2)將剪碎的滑膜小塊，先離心洗滌 2 次，去除脂肪組織，再進行消化，更有利于貼壁；(3)型膠原酶的濃度改為 0.2%，消化 2 h；胰蛋白酶濃度為 0.25%，消化 30 min，消化過程每隔 10 min

10、吹打 1 次，不僅消化較完全，而且減輕了對滑膜細胞的損傷，以提高細胞活力；(4)傳代培養(yǎng)時胰蛋白酶的濃度為 0.08%，更有利于滑膜細胞貼壁生長。1.5AA 大鼠滑膜細胞的增殖用含 15% 小牛血清DMEM 培養(yǎng)液制備原代滑膜細胞懸液(2×109/L)，加至 96 孔培養(yǎng)板，每孔 100 L，置 37、5%CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h，貼壁后換不含血清的 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng) 24 h，使細胞相對同步化。吸出無血清培養(yǎng)液，加入含 15% 小牛血清DMEM 培養(yǎng)液各 100 L，繼續(xù)培養(yǎng) 66 h 后， 各孔加 MTT(5 mg/L) 溶液 20 L，繼續(xù)培養(yǎng) 6 h 后，棄上清液，加

11、入二甲基亞砜 100 L，振蕩 3 min后用酶標儀檢測每孔 D(490nm)(光密度，即 OD 值)，以正常大鼠滑膜細胞為對照組，每組以 3 孔的均值表示其結(jié)果。1.6細胞因子的誘生和檢測細胞因子的誘生參照文獻7進行；IL-1 活性檢測采用 C57BL/6 雌性小鼠胸腺細胞增殖法，按文獻2進行。 TNF- 活性檢測采用 L929 細胞殺傷法 ，按文獻3 進行。前列腺素 E2 免疫測定，采用放射免疫法，按試劑盒說明進行。1.7統(tǒng)計學(xué)處理測定值以(<"0201 (143 bytes)" src="/med/cano/201003/201003231839162

12、35" 37 17>)表示，顯著性檢驗用 t 檢驗。2結(jié)果2.1 AA 大鼠原代滑膜細胞的形態(tài)學(xué)觀察原代滑膜細胞貼壁前為圓形，分離的滑膜細胞培養(yǎng) 6 h 后開始貼壁，24 h 后，均貼壁并伸出生長突，48 h 可明顯分辨出 3 種類型的細胞，即樹突樣細胞(DCs)、巨噬細胞樣細胞(MCs)和成纖維細胞樣細胞(FCs)，以FCs 成分為主。DCs胞質(zhì)延展形成許多細長的突起，呈星狀或放射狀，這些突起可以形成分叉與鄰近的細胞突起相互交叉，胞質(zhì)中含有大量密度不同的球狀顆粒；MCs 呈卵圓形或菱形，胞質(zhì)突起較短，有 1 個較圓的致密細胞核，這類細胞與 A 型滑膜細胞相似；FCs 胞核呈紡

13、錘形或方柱形，細胞核呈卵圓形，與 B 型滑膜細胞相似。 DCs 和MCs 分裂增殖較 FCs 緩慢，較少見分裂相細胞，F(xiàn)Cs 增殖較快。但正常大鼠滑膜細胞中只有 MCs 和FCs，不存在DCs。 AA 大鼠滑膜細胞中還出現(xiàn)滑膜巨細胞，呈巨噬細胞樣，細胞核 28 個不等，而正常大鼠滑膜細胞中則沒有。傳代培養(yǎng)的細胞，接種 2 h 后即開始貼壁， 12 h 后全部貼壁并伸出生長突。傳代細胞以 FCs 為主，細胞呈梭形，增殖活躍，核分裂相細胞多，有些細胞呈集落性生長，長滿后呈極向排列。2.2AA 大鼠滑膜細胞的增殖D(490nm)(光密度，前稱 OD 值)在本實驗中代表滑膜細胞在同一時間內(nèi)增殖的多少。

14、表1表明：同正常大鼠相比， AA 大鼠滑膜細胞增殖增加(P0.01)。2.3AA 大鼠滑膜細胞的分泌功能表1結(jié)果表明：同正常大鼠相比，AA 大鼠滑膜細胞培養(yǎng)上清中IL-1、TNF-活性和PGE2含量均升高(P0.01或P0.001)。表1滑膜細胞的增殖及培養(yǎng)上清中IL-1，TNF-的活性和PGE2含量的變化(<"0201 (143 bytes)" src="/med/cano/201003/20100323183916235" 37 17>)組別N/只D滑膜細胞的增殖DIL-1JTNF-/(kU.L-1)PGE2/(g.L-1)正常組60.2

15、17±0.0240.343±0.02742.5±3.75.1±0.5AA組60.270±0.033*0.640±0.038*65.4±4.8*7.9±0.6*     *與正常組相比P0.01，*P0.001 3討論原代培養(yǎng)細胞離體時間短，其生物學(xué)特性和遺傳性基本與體內(nèi)相似，無自發(fā)性變異，是細胞形態(tài)、機能、分化等研究的理想材料。本實驗在王斌等1實驗的基礎(chǔ)上進行了改進，提高了分離的滑膜細胞的活性，減少了細菌的污染，提高了成功率。實驗中觀察到分離、培養(yǎng)的AA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細胞具有

16、三種不同的形態(tài)，即巨噬細胞樣細胞(MCs)、樹突狀細胞(DCs)、成纖維細胞樣細胞(FCs)。這與 Goto等4采用細胞克隆方法培養(yǎng)的RA患者關(guān)節(jié)滑膜細胞的形態(tài)特征相似。正常大鼠滑膜細胞中只有MCs、FCs兩種形態(tài)細胞，而沒有DCs。目前滑膜樹突狀細胞起源還不肯定，國外研究5表明在RA患者滑膜組織及滑膜液中存在相當量的DCs，具有很強的抗原呈遞能力，尤其是呈遞超抗原的能力。在三型細胞中DCs產(chǎn)生IL-1的能力最強，而且可能是合成和分泌膠原蛋白酶原的主要細胞。DCs在RA病理機制中的作用已引起國內(nèi)外的廣泛重視。正常情況下滑膜細胞的增殖率很低，而RA患者的滑膜細胞分裂、增殖加快，我們采用MTT法檢

17、測AA大鼠滑膜細胞的增殖效應(yīng)發(fā)現(xiàn)也存在同樣的情況，其增殖明顯增加。而且AA大鼠滑膜細胞培養(yǎng)上清中IL-1、TNF-的活性和PGE2的含量升高，說明AA大鼠存在明顯的細胞免疫異常。IL-1、TNF-被認為是RA發(fā)病機理中居于中心地位的促炎癥細胞因子，是關(guān)節(jié)軟骨破壞的最重要的炎癥介質(zhì)6。高濃度的PGE2能使骨組織吸收破壞增加，也是RA病理機制中的重要炎癥介質(zhì)。高調(diào)節(jié)的滑膜細胞產(chǎn)生大量的IL-1、TNF-，刺激了滑膜細胞的增殖，而異常增殖的滑膜細胞又進一步增強了IL-1、TNF-的分泌，從而促進了AA大鼠關(guān)節(jié)損傷的病理進展。總之，AA大鼠與人類RA有相似的細胞免疫異常表現(xiàn)，可以作為人類RA的較理想的

18、疾病模型。RA早期的病變位于滑膜，其滑膜細胞功能的改變直接影響RA病理進程。體外檢測AA大鼠滑膜細胞的功能，為從細胞和分子水平評價和篩選抗風濕病藥物及其作用機制提供了理想的實驗手段?；痦椖浚簭V東省自然科學(xué)基金資助課題，編號：960550作者簡介：沈曉燕，女，碩士研究生作者單位：沈曉燕（廣州中醫(yī)藥大學(xué)96級研究生,廣州510405）馬偉（廣州中醫(yī)藥大學(xué) GLP 中心，廣州510405）趙會芳（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院綜合病區(qū)，廣州510405）參考文獻：1王斌，陳敏珠，徐叔云.大鼠滑膜細胞的分離和培養(yǎng)J.中國藥理學(xué)通報，1994，10(1)：732于孟學(xué)，張麗華，史立，等.風濕性疾病患者滑膜培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-及PGE2的動態(tài)觀察J.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，1994，16(3)：1923王斌，陳敏珠，徐叔云.白芍總甙對大鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子的影響J.中國藥理學(xué)通報，1995，11(1)：364Goto M,Sasano M,Yamanka H,et al.Spontaneous Production of an interleukin-l-like factor by cloned rheumatoid synovial cells in long-term c