重癥肺炎模型定量病理學(xué)研究

1、重癥肺炎模型定量病理學(xué)研究        【摘要】     目的 用體視學(xué)方法定量研究SD（Sprague Dawley）大鼠細(xì)菌性重癥肺炎模型病理的三維形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及變化規(guī)律。方法 SD大鼠隨機(jī)分為模型組、觀察組和對(duì)照組(每組分為3小組，前兩組每小組8只，對(duì)照組每小組4只)。其中，模型組和觀察組分別接種相同濃度不同劑量的肺炎克雷伯菌菌液，對(duì)照組接種與模型組劑量相同的生理鹽水。分別于接種后的第2、4、6天分批處死動(dòng)物。留取肺組織標(biāo)本，HE染色，每張切片隨機(jī)取34個(gè)視

2、野，用Image-Pro圖像分析軟件分別測(cè)試肺實(shí)質(zhì)紅細(xì)胞體積密度、支氣管殘余管腔體積密度、肺泡體積密度。結(jié)果 隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組、觀察組的肺實(shí)質(zhì)紅細(xì)胞體積密度的變異系數(shù)逐漸增大，尤以模型組增大明顯；模型組、觀察組的支氣管殘余管腔體積密度變異系數(shù)逐漸減小，尤以模型組明顯；模型組、觀察組肺泡體積密度的變異系數(shù)逐漸變小，尤以模型組明顯。對(duì)照組則無明顯變化。結(jié)論 隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組、觀察組病變逐漸加重，尤以模型組更為明顯。在病理體視學(xué)上表現(xiàn)為：紅細(xì)胞在整個(gè)肺組織中的體積增加；支氣管殘余管腔與原始管腔的比積減??；肺泡腔與整個(gè)肺實(shí)質(zhì)體積比減小。    

3、0;【關(guān)鍵詞】  大鼠模型；重癥肺炎；肺炎克雷伯菌；體視學(xué)；定量；三維結(jié)構(gòu)    A Quantitatively Pathological Study in Rat Model of Severe PneumoniaChen Yemin, Hou Tongchuan, Bo Zhengming, Shen HongMilitary Hospital No. 41, Shannan, Tibet Autonomous Region 856000ABSTRACT  Objective  To make a quantitati

4、ve study of the characteristics and the change law of the pathological 3d structure of severe bacteria pneumonia model in Sprague-Dawley (SD) rats with stereological method. Methods  The SD rats were randomly divided into 3 groups: model group, observation group and control group; rats in model

5、 group and observation group were inoculated with Klebsiella pneumonia suspension at different doses while rats in control group were inoculated with saline at the same dose of the suspension in model group; the rats in each group were scarified at each time intervals (2d, 4d and 6d after inoculatio

6、n) respectively, and the lung tissue specimens were collected and were stained with HE; 3 to 4 visual fields from each section were selected and the volume density of the erythrocyte, the alveolus and the residual lumens of bronchi in the lung parenchyma were analyzed with the Image-Pro image analys

7、is system. Results  With the time prolonged, the coefficient of variation (CoV) of volume density of the erythrocyte in the lung parenchyma in model group and observation group kept increasing, especially that in model group; the CoV of volume density of the alveolus and the residual lumens in

8、model group and observation group kept decreasing, especially that in model group; no obvious changes were found in control group.Conclusions  The pathological changes in model group and observation group will get more and more severe with the time of inoculation prolonged, especially those in

9、model group; the pathological stereological manifestations are the erythrocyte volume increase in the whole lung tissue, the volume ratio decrease of the residual lumens to the origioal lumen of the bronchi and volume ratio decrease of the alveolar space to the whole lung parenchyma.KEYWORDS  r

10、at model  severe pneumonia  Klebsiella pneumoniae   stereology  Quantitative  3-dimension structure    目前，肺炎的病理及形態(tài)定量研究主要集中在電鏡、光鏡等二維水平的病理結(jié)構(gòu)方面。我們于2005年12月成功建立重癥肺炎動(dòng)物模型1，留取肺組織標(biāo)本，采用體視學(xué)定量方法對(duì)重癥肺炎模型病理進(jìn)行三維空間的形態(tài)定量研究，從三維水平上定量認(rèn)識(shí)重癥肺炎模型形態(tài)結(jié)構(gòu)的基本特點(diǎn)和變化規(guī)律。1  材料與方法1.1&#

11、160; 病原肺炎克雷伯菌臨床株由我院檢驗(yàn)科細(xì)菌室提供，分離于慢性支氣管炎急性發(fā)作病人的痰液。接種前生理鹽水稀釋致適當(dāng)濃度（相當(dāng)于1.2×109CFU/ml）。1.2  動(dòng)物與分組 清潔級(jí)Sprague Dawleg(SD)雄性大鼠60只，鼠齡為58個(gè)月，質(zhì)量180260g。隨機(jī)分為模型組、觀察組和對(duì)照組，前兩組每組分為3小組，每小組8只，對(duì)照組每小組4只。分別于接種后的第2、4、6天分批處死動(dòng)物。其中模型組分別于接種后的第5、第6天各死亡1只，后補(bǔ)做。1.3  接種 動(dòng)物麻醉后，頸部消毒、備皮無菌操作，暴露大鼠上段氣管，用1ml注射器經(jīng)氣管滴

12、入菌液。其中，觀察組滴入0.15ml，模型組滴入0.3ml，對(duì)照組滴入相同劑量的生理鹽水。接種后立即豎立大鼠固定臺(tái)，使大鼠保持直立位約20s，以保證接種菌液因重力作用而入肺。1.4  取材和標(biāo)本收集 分別于接種后的第2、4、6天分批處死動(dòng)物。無菌開胸取肺，肺組織以5%的福爾馬林液固定、石蠟包埋，切片HE染色。1.5  分析方法和圖像分析軟件 病理標(biāo)本HE染色，肺實(shí)質(zhì)紅細(xì)胞體積密度、肺泡體積密度每張切片在40倍，支氣管殘余管腔體積密度在10倍物鏡下隨機(jī)取34個(gè)視野，經(jīng)Leica顯微攝像系統(tǒng)輸入計(jì)算機(jī)，用Q500MC型圖像分析軟件分別測(cè)試。測(cè)試前，用物鏡測(cè)微

13、尺對(duì)該軟件進(jìn)行標(biāo)定，分別測(cè)試標(biāo)本的面積和周長(zhǎng)。1.6  體視學(xué)參數(shù)的選用和計(jì)算 選用的測(cè)量參數(shù)有：支氣管殘余管腔的體積密度；肺泡腔的體積密度；肺實(shí)質(zhì)中紅細(xì)胞的體積密度。根據(jù)Q500MC型圖像分析軟件的測(cè)試結(jié)果，按體視學(xué)公式計(jì)算出所測(cè)得的參數(shù)2。1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)數(shù)資料所有數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，參數(shù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，表示采用單因素方差分析。2  結(jié)  果2.1  臨床表現(xiàn)  動(dòng)物接種第一天，觀察組和模型組均出現(xiàn)煩躁、活動(dòng)增強(qiáng)，體溫升高達(dá)39.4。第2、3天動(dòng)物進(jìn)食、

14、活動(dòng)度明顯下降，毛發(fā)直豎，卷曲于飼養(yǎng)籠角落，尤以模型組動(dòng)物明顯。從第4天起，動(dòng)物食欲、活動(dòng)度進(jìn)一步下降，模型組大鼠部分出現(xiàn)嗜睡（觸之可醒），可聞及明顯呼吸喘鳴聲，最高體溫達(dá)41.3，觀察組最高體溫達(dá)40.1，第5、第6天，觀察組和模型組上訴癥狀進(jìn)一步加重，尤以模型組動(dòng)物明顯，體重減輕，出現(xiàn)明顯骨感。模型組部分大鼠顏面部、四肢出現(xiàn)紫紺，呼吸急促，呼吸困難。模型組于第5、6天各死亡1只（后補(bǔ)做）。對(duì)照組大鼠進(jìn)食、活動(dòng)度、體重、體溫較接種前無明顯變化。2.2  各組支氣管殘余管腔的體積密度 接種后的第2天，各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.05）；隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組、觀察組支氣

15、管殘余管腔的體積密度值逐漸減小，尤以模型組明顯。于第4天始模型組與觀察組、對(duì)照組比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.05，0.01），見表1。表1  各組支氣管殘余管腔的體積密度（略）注：與觀察組、對(duì)照組及模型組的第2天比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （0.05）；與觀察組、對(duì)照組比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.01）。2.3  各組肺泡腔的體積密度 接種后的第2天，各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.05）；于接種的第4天，模型組肺泡腔體積密度明顯減少，與觀察組、對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.05，0.01），而觀察組與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.05）；于接種后的第6天，觀察組、模型組肺泡腔

16、體積密度進(jìn)一步下降，尤以模型組下降明顯，與各組比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.01），而對(duì)照組則無明顯變化，見表2。表2  各組肺泡腔的體積密度（略）注：與觀察組、對(duì)照組及模型組的第2天比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.05，0.01）；與觀察組、對(duì)照組比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.01）2.4  各組肺組織紅細(xì)胞的體積密度 于接種后的第2天開始，觀察組、模型組的肺組織紅細(xì)胞體積密度逐漸升高，尤以模型組升高明顯；從第2天開始，模型組與觀察組、對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.05）；而觀察組與對(duì)照組則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.05），對(duì)照組則無明顯變化，見表3。表3  各組肺組織

17、紅細(xì)胞的體積密度（略）注：與觀察組、對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.05）3  討  論    肺炎是威脅人類健康的重要疾病。近幾十年來，重癥肺炎的病死率幾乎沒有下降，隨著耐藥菌的不斷增加，需要開發(fā)新的非抗生素治療策略，這就需要我們更好地理解重癥肺炎的病理生理特點(diǎn)3。國內(nèi)外學(xué)者正在積極探索對(duì)重癥肺炎新的治療途徑，如細(xì)胞因子、免疫治療等。我們通過病理體視學(xué)檢測(cè)，從三維定量的角度來認(rèn)識(shí)重癥肺炎模型的病理變化特點(diǎn)和變化規(guī)律。有利于對(duì)重癥肺炎的全面認(rèn)識(shí)、疾病發(fā)展的分期及預(yù)后進(jìn)行判斷和評(píng)估。    生物體視學(xué)是由幾何學(xué)、概率學(xué)

18、、微積分、拓?fù)鋵W(xué)、定量分析技術(shù)、生物組織學(xué)和圖像分析技術(shù)有機(jī)結(jié)合，由二維結(jié)構(gòu)信息定量推論三維結(jié)構(gòu)信息的新興邊緣學(xué)科4。其中定量病理學(xué)是生物體視學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域的重要組成部分5。其研究范疇涉及絕大多數(shù)系統(tǒng)、組織、細(xì)胞及大部分的亞微結(jié)構(gòu)68。而對(duì)重癥肺炎的病理定量研究目前國內(nèi)未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本文旨在這方面作一些初步探索。    我們所選擇支氣管殘余管腔的體積密度、肺泡腔的體積密度、肺實(shí)質(zhì)中紅細(xì)胞的體積密度這三個(gè)測(cè)量參數(shù)能夠較為準(zhǔn)確、客觀地反映重癥肺炎模型肺組織病理變化的嚴(yán)重程度。支氣管殘余管腔的體積密度是指單位體積支氣管原始管腔中支氣管殘余管腔所占的體積。當(dāng)管腔因炎癥、阻

19、塞等原因致使支氣管管腔受損破壞，其體積密度減小。其體積密度的變化隨著支氣管管腔受損程度的變化而變化，當(dāng)支氣管管腔炎性滲出物越多，其體積密度越小。肺泡腔的體積密度是指單位體積的肺實(shí)質(zhì)中肺泡腔所占的體積。當(dāng)肺實(shí)質(zhì)因炎癥、水腫、滲出、出血等原因，導(dǎo)致肺泡腔體積減小，則肺泡腔體積密度降低。其體積密度的變化隨著肺實(shí)質(zhì)炎性滲出的變化而變化，當(dāng)肺泡腔炎性滲出越多，其體積密度越小。本文中肺泡紅細(xì)胞的體積密度是指單位體積的肺實(shí)質(zhì)中紅細(xì)胞所占的體積。當(dāng)肺組織因炎癥或其他因素導(dǎo)致肺組織出血、充血，其體積密度增加。其病變?cè)街?，出血、充血越明顯，其體積密度越大。本研究中，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組的病情加重，在體視學(xué)上

20、表現(xiàn)為支氣管殘余管腔的體積密度、肺泡腔的體積密度呈進(jìn)行性減小，肺泡中紅細(xì)胞的體積密度則逐漸升高。模型組的病理體視學(xué)變化趨勢(shì)與重癥肺炎模型的血液動(dòng)力學(xué)、動(dòng)脈血?dú)夥治鲎兓内厔?shì)是一致的1。即隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，接種大劑量菌液的模型組其病理改變較觀察組、對(duì)照組明顯加重。這從定量病理學(xué)上進(jìn)一步驗(yàn)證我們成功建立重癥肺炎動(dòng)物模型。從本研究中可以看出，重癥肺炎由于炎性滲出、出血多，管腔狹窄明顯，致使血?dú)夥治?、血液?dòng)力學(xué)發(fā)生改變。改善其通氣狀況可能為扭轉(zhuǎn)病情發(fā)展的關(guān)鍵。    隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組大體肉眼所見肺組織為深紅色，可見肺組織廣泛出血，彈性差，于第6天用手觸摸有實(shí)質(zhì)

21、感。觀察組肺組織均為淡紅色，可見肺組織出血點(diǎn)。對(duì)照組肺組織均為淡白色，彈性良好。電鏡觀察可見對(duì)照組肺組織形態(tài)大致正常；觀察組支氣管周圍、肺泡壁充血，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著接種后時(shí)間的延長(zhǎng)，上述病理改變成逐漸加重的趨勢(shì)；模型組于第6天電鏡下所見各級(jí)支氣管周圍大量白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)可見肺組織廣泛出血，肺泡壁廣泛受到破壞。    【參考文獻(xiàn)】  陳業(yè)民，黃文杰，李勝利等. 肺炎克雷伯菌致大鼠重癥肺炎模型的建立. 第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25（12）：14981502.申洪，沈忠英. 實(shí)用生物體視學(xué)技術(shù).廣州：中山大學(xué)出版社. 1991.Waterer GW, Wunderink RG, Genetic susceptibility to pneumonia. Clin Chest Med 2005，26:2938.Manoonkitiwongsa P S, Mcmillan P J, Schultz R L, et al. A simple stereologic meth