冷榨花生餅制備花生多肽的研究

1、 冷榨花生餅制備花生多肽的研究 何東平1, 2，張世宏2，肖吉娜2，楊大芳2 （1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)430070 武漢市; 2.武漢工業(yè)學(xué)院，430023 武漢市）摘要：本研究對(duì)影響花生蛋白水解得花生多肽的各種影響因素，如酶制劑的篩選，酶解工藝參數(shù)等進(jìn)行了系統(tǒng)研究。通過正交實(shí)驗(yàn)，得到最佳工藝參數(shù)是pH值7.0、溫度42、加酶量6500U/g原料、酶水解時(shí)間8h、底物濃度10%。關(guān)鍵詞：冷榨花生餅; 花生蛋白;中性蛋白酶;酶水解;花生多肽A study on the extraction of peanut peptides from the cold pressing cake of peanut

2、Abstract：In this paper ,many factors that affect the extracting of peanut peptides such as the selection of enzymes and the hydrolysis parameters of protease were studied .The optimum conditions were obtained by orthogonal design test: pH values 7.0,temperature 42,time 8h,enzyme/substrute 6500U/g,su

3、bstrate concentration 10%. Keywords：cold pressing cake of peanut；peanut protein；neutral protease enzyme; enzymatic hydrolysis; peanut peptides花生是世界上主要的油料資源之一，在世界植物油資源中占第四位，約占世界油料產(chǎn)量的14%1。我國(guó)花生資源也很豐富，是我國(guó)的六大油料作物之一。但在我國(guó)花生除直接食用外，主要用于榨油，對(duì)榨油后的粕并未很好地利用。而其卻是一種很好的植物蛋白資源，其中含有近50%的蛋白質(zhì)?；ㄉ鞍椎臓I(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，它對(duì)維護(hù)人體健康和幼兒發(fā)育具有

4、重要作用。人們的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)經(jīng)水解制得的肽有比蛋白質(zhì)更好的營(yíng)養(yǎng)性能，實(shí)驗(yàn)證實(shí)肽的吸收率比氨基酸大2，比氨基酸更易、更快通過小腸粘膜被人體吸收利用。作者簡(jiǎn)介: 何東平(1957-),男,教授; 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)在職博士生,主要從事油脂及植物蛋白研究開發(fā)工作。生物活性肽的生產(chǎn)主要有合成與蛋白質(zhì)體外水解兩種方法。合成法主要有化學(xué)合成、DNA重組技術(shù)合成、酶法合成三種法。合成法雖然可按人們的意愿合成任意活性肽，但目前因?yàn)槌杀靖摺⒏狈磻?yīng)物多及殘留化合物等問題制約著其發(fā)展，其中重組DNA技術(shù)如果有望成功，將會(huì)有廣闊前景。體外水解蛋白質(zhì)為肽有三條工藝路線：酸水解，堿水解及酶法水解。前二者方法簡(jiǎn)單易操作，但可

5、能存在營(yíng)養(yǎng)和毒理方面有害的效應(yīng)，因此，在食品加工的應(yīng)用受到了極大的限制。蛋白質(zhì)的酶法水解一般不會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)方面的損失，也不會(huì)產(chǎn)生毒理上的問題。同時(shí)酶作用具有特異性，可在溫和條件下進(jìn)行，能耗低。實(shí)驗(yàn)證實(shí)3,經(jīng)過sephadexG-25凝膠層析以及電泳實(shí)驗(yàn),可知花生多肽中主要含有三個(gè)組分,大分子量在17000D左右,中分子量在14200D左右,低分子量在3500D左右。另外在1000D也有少量的多肽。花生多肽有很多功能特性。其易消化、吸收快的營(yíng)養(yǎng)特性，可以作為腸吸收營(yíng)養(yǎng)物和流態(tài)食物，使患者直接從口胃送入這種營(yíng)養(yǎng)物，迅速獲得營(yíng)養(yǎng)上的補(bǔ)充；其促進(jìn)脂肪代謝的功能，可以較快地將脂肪轉(zhuǎn)化為能量，補(bǔ)充運(yùn)動(dòng)員的體

6、能；它促進(jìn)微生物的發(fā)育和代謝的作用，還可以將其用于生產(chǎn)酸奶、干酪、醋、面包、醬油和發(fā)酵火腿等食品中，提高生產(chǎn)效率、改善品質(zhì)的穩(wěn)定性、營(yíng)養(yǎng)性及風(fēng)味；花生多肽吸濕性和保濕性能好，可使產(chǎn)品軟化、改善口感，所以用來生產(chǎn)各種花生制品，品質(zhì)和風(fēng)味更佳，且營(yíng)養(yǎng)豐富。本研究利用酶法水解工藝提取制備營(yíng)養(yǎng)性花生多肽，對(duì)酶解工藝中的多種影響因素、工藝參數(shù)進(jìn)行了研究，探索出了酶法水解花生粕的最佳工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1材料和儀器1.1 主要原料和試劑花生冷榨餅， AS1.398中性蛋白酶（測(cè)得酶活力為13.0萬(wàn)U/g），氫氧化鈉，檸檬酸，正己烷，亞硫酸鈉。 1.2 主要設(shè)備浸出器，HHS型恒溫水浴鍋，JB90-D型（50

7、-1400r/min）強(qiáng)力電動(dòng)攪拌機(jī)， GZX-9070 ME數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，LD5-10型離心機(jī)，天平，量筒， RES2CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SHZ-型循環(huán)水真空泵，微量凱式定氮儀。1.3 測(cè)定方法 花生粕中各組分的測(cè)定蛋白質(zhì)測(cè)定方法 GB5511水份測(cè)定方法 GB5491粗脂肪測(cè)定方法 GB5512粗纖維測(cè)定方法 GB5515 酶活力的測(cè)定 Folin-酚法4 蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定5-7測(cè)定公式W(%)=(N2-N1)/(N0-N1)×100N0: 花生蛋白中的總氮量;N1: 酶解前花生蛋白溶液在10%TCA中的可溶性氮量;N2: 酶解后酶解液在10%TCA中的可溶性氮;式中的氮是由微

8、量凱氏定氮法8測(cè)定。 三氯乙酸（TCA）可溶性氮測(cè)定9 量取蛋白水解液10ml，加入10%三氯乙酸10ml與之混合，放置20min后，在4000r/min下離心15min，用凱式定氮法測(cè)定上清液的可溶性氮濃度。 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用茚三酮法10進(jìn)行酶解條件的單因子實(shí)驗(yàn)，分別改變酶液用量，底物濃度和酶解時(shí)間，溫度，確定了正交實(shí)驗(yàn)中各因素的三個(gè)水平。按L9(34)正交表安排四因素和各自的三水平。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 工藝流程花生冷榨餅浸出（50，兩次各3h）堿溶（粕水比1：10，502h，加3mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值8.5左右）離心（3500r/min,10min）上層清夜酸沉（加3mol/L檸檬酸

9、，pH4.5）離心下層沉淀煮沸冷卻酶水解滅活（加檸檬酸，pH4.0-4.5）離心脫色（加入占溶液重35%的活性碳，30水浴鍋中保持30min且持續(xù)攪拌）抽濾真空干燥（旋風(fēng)蒸發(fā)器，506h）花生多肽2.2 工藝操作簡(jiǎn)介將堿溶酸沉后所得蛋白質(zhì)溶于1：10的水中，將其放入10011的恒溫水浴鍋中加熱30min。待冷卻到45，加入亞硫酸鈉保溫?cái)嚢?h12，據(jù)實(shí)驗(yàn)表明，這樣可提高蛋白質(zhì)的水解度13。將上述溶液降溫至42，然后放入恒溫水浴鍋中，調(diào)pH為7.0左右且保持不變，加入6500U/g原料蛋白酶，不停的攪拌，酶水解8h。3 結(jié)果討論 3.1 花生粕中各組分的測(cè)定值 見表1表1項(xiàng) 目蛋 白 質(zhì)水 分脂

10、 肪粗 纖 維數(shù) 據(jù)（%）47.111.03.67.03.2 酶的篩選實(shí)驗(yàn)證實(shí)14，常用的三種酶水解花生粕蛋白的能力，由大到小依次為AS 1.398中性蛋白酶>木瓜蛋白酶>胰酶，說明中性蛋白酶對(duì)底物的肽鍵選擇性大、作用肽鍵多、故選用AS 1.398中性蛋白酶為水解花生蛋白的作用酶。3.3 酶水解適宜條件的確定 最佳酶法水解蛋白工藝條件的確定.1 AS 1.398蛋白酶最行之有效作用溫度的確定調(diào)節(jié)一系列10%物料溶液，其pH均為7.0，分別加入6500U/g,在不同溫度下保溫2h，然后進(jìn)行離心，清洗分離，測(cè)定不同酶解溫度下所得產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見圖1。 圖1 不同酶作用溫度對(duì)酶解

11、液蛋白質(zhì)含量的影響從圖1中可看出，在上述給定條件下，AS1.398蛋白酶的最適作用溫度為4045，此時(shí)酶解蛋白效果最好。.2 AS1.398蛋白酶最佳酶解時(shí)間的確定調(diào)節(jié)一系列10%物料溶液，pH為7.0，分別加入6500U/g原料蛋白酶，在40下保溫不同時(shí)間進(jìn)行離心、清洗、分離，測(cè)不同酶解時(shí)間下所得產(chǎn)物的蛋白含量。結(jié)果見圖2。 圖2 不同酶作用時(shí)間對(duì)酶解液蛋白質(zhì)含量的影響從圖2可以看出，AS1.398蛋白酶作用8h后，蛋白質(zhì)含量不再有明顯的下降。因此，蛋白酶作用后用8h后，即可中止反應(yīng)。.3 AS1.398蛋白酶最適用量的確定調(diào)節(jié)一系列10%物料溶液，pH7.0，分別加入不同量蛋白酶，40保溫

12、2h，然后離心清洗分離測(cè)不同酶用量下所得產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見圖3。 圖3 不同酶作用對(duì)酶解液蛋白質(zhì)含量的影響由圖3可以看出，當(dāng)酶用量達(dá)到6500U/g原料時(shí)，產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量不再明顯下降，且有緩慢上升。這可能是由于蛋白酶水解蛋白質(zhì)的同時(shí)，也具有從蛋白質(zhì)的水解物合成蛋白質(zhì)類物質(zhì)的能力。因此，蛋白酶用量不宜過大。.4 底物最適濃度的確定 配一系列不同底物濃度的溶液，在pH7.0，加酶6500U/g，40下保溫2h，離心、清洗、分離測(cè)水解產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見圖4。 圖4 不同底物濃度對(duì)酶解液蛋白質(zhì)含量的影響由圖4可以看出，當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?0%時(shí)，隨底物濃度增加，產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量亦增加。.5 正交

13、實(shí)驗(yàn)將水解溶液的pH定為7.0，采用L9(3)正交表，以蛋白質(zhì)水解度為指標(biāo)，擬定出實(shí)驗(yàn)方案（見表2）來考察底物濃度、酶用量、溫度、時(shí)間4個(gè)因素對(duì)水解的影響，并得到相應(yīng)結(jié)果（見表3）。實(shí)驗(yàn)方案表2實(shí)驗(yàn)號(hào)A底物濃度（%）B（酶用量/U/g原料） C（溫度）D（時(shí)間h）1 839004072 1052004283 126500459實(shí)驗(yàn)條件與結(jié)果表3 A B C D蛋白質(zhì)水解度1 8390040772.952 85200428 85.543 8650045984.684 103900429 89.445 10520045779.676 10650040890.347 12390045875.508

14、12520040980.959 12650042788.45K1 243.17237.89244.24241.07K2 259.45246.16263.43251.38K3 244.90263.47239.85255.07k1 81.0679.3081.4180.36k2 86.4882.0587.8183.79k3 81.6387.8279.9585.02R 5.428.527.864.66 從表3可以看出，在影響花生粕蛋白水解程度的4個(gè)因素中B>C>A>D,最佳水解條件：A2B3C2D3,即蛋白質(zhì)底物濃度為10%，酶用量為6500U/g原料，溫度為42，酶解時(shí)間為8h。 4 結(jié)論4.1用亞硫酸鈉前處理蛋白質(zhì)水溶液可以提高酶解程度。4.2花生粕經(jīng)堿溶酸沉后，采用中性蛋白酶在酶用量6500U/g原料，溫度為42，時(shí)間為8h，pH值為7.0的條件下進(jìn)行水解，得到相應(yīng)的水解蛋白，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率高。4.3由于絕大多數(shù)的花生粕蛋白被水解變?yōu)榈碗暮桶被?，提高了其在花生蛋白等電點(diǎn)附近的水溶性，而且花生多肽在高濃度時(shí)仍顯示低的粘度，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。 參考資料5 趙新淮，等.蛋白質(zhì)水解物水解度的確定J.食品科學(xué)，1994（11）：65-67.6 Alder-Nissen J.Enzyme