二元致孔劑微電滲流電泳柱的制備及性能考察

1、二元致孔劑微電滲流電泳柱的制備及性能考察項(xiàng)目完成單位：國(guó)家色譜研究分析中心項(xiàng)目完成人：張凌怡 平貴臣 張麗華 張維冰 張玉奎摘 要 采用二元致孔劑原位聚合的方法合成了一種新型微電滲流毛細(xì)管電泳原位柱。與三元致孔劑的方法相比，它具有制備過程簡(jiǎn)單、重復(fù)性好以及柱床的孔徑和孔結(jié)構(gòu)易于調(diào)節(jié)等特點(diǎn)。得到的毛細(xì)管柱內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻，通透性好。系統(tǒng)地研究了各種參數(shù)對(duì)孔結(jié)構(gòu)及電滲流的影響，結(jié)果表明制備的原位柱在較大pH值和有機(jī)改性劑濃度條件下，電滲流均能保持在較低值，可以適應(yīng)不同電泳分離模式的需要。關(guān)鍵詞 原位聚合；微電滲流毛細(xì)管柱；致孔劑；電滲流1 引 言整體材料是近年來發(fā)展起來的一種新型分離介質(zhì)，已被應(yīng)用于色

2、譜、毛細(xì)管電泳等多種分離模式，被譽(yù)為第四代填料1?；谶@種材料的原位柱技術(shù)已引起色譜工作者的廣泛關(guān)注。原位柱分為聚合物原位柱2-19和硅膠原位柱20兩類。聚合物原位柱在制備時(shí)選材范圍廣，可以使分離柱具有不同的選擇性，并且適用的pH范圍寬。較傳統(tǒng)填充柱和開管柱具有諸多明顯的優(yōu)點(diǎn)。聚合物原位柱的制備通常是將單體、引發(fā)劑、致孔劑和電滲流產(chǎn)生劑等混合后置入內(nèi)表面經(jīng)過處理的毛細(xì)管中。在適當(dāng)條件下引發(fā)反應(yīng)，使其在毛細(xì)管內(nèi)形成具有一定孔結(jié)構(gòu)的整體床層，作為分離介質(zhì)實(shí)現(xiàn)對(duì)不同性質(zhì)樣品的分離分析。然而電滲流的存在可能對(duì)分離產(chǎn)生負(fù)面影響。例如，在毛細(xì)管等電聚焦中，電滲流是導(dǎo)致聚焦區(qū)帶展寬的主要原因之一。微電滲流整

3、體柱是最近才提出的一種新型分離柱。2001年Wu等15在Anal. Chem.上發(fā)表了第一篇相關(guān)的研究論文，之后他們又對(duì)此作了系列的研究工作16-18。實(shí)際上，微電滲流柱即是在原來正常整體柱的基礎(chǔ)上，在制備過程中不加入相應(yīng)的電滲流產(chǎn)生劑而得到的具有特殊孔結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)的分離柱。我們最近的研究也表明19這種柱具有多種功能，可應(yīng)用于毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管電色譜、毛細(xì)管等電聚焦等多種分離模式。在正常整體柱的制備過程中，通常采用包括水在內(nèi)的三元致孔劑。其中，水主要作為電滲流產(chǎn)生劑的載體。盡管微電滲流柱仍沿用一般整體柱的制備方法，但在制備過程中水的作用已無意義。同時(shí)由于水的強(qiáng)極性和可形成氫鍵的性質(zhì)也可能

4、會(huì)對(duì)微電滲流柱的功能產(chǎn)生影響。本文設(shè)計(jì)了一種采用無水的二元致孔劑制備微電滲流柱的方法。與三元致孔劑的方法相比，具有制備過程簡(jiǎn)單、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。此外，還能夠通過調(diào)節(jié)致孔劑配比方便地改變柱床的孔徑和孔結(jié)構(gòu)。2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 儀器與試劑Beckman P/ACE System 5010毛細(xì)管電泳儀（Beckman公司，美國(guó)）；熔融石英毛細(xì)管27cm（有效長(zhǎng)度20cm）×75µm i.d.×375µm o.d.(河北永年光導(dǎo)纖維廠)。甲基丙烯酸丁酯（BMA），乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA），1，4-丁二醇（Fluka化學(xué)公司）；-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅

5、烷正丙醇（MAPS） (Acros化學(xué)公司)；正丙醇（天津博迪化學(xué)試劑公司），偶氮二異丁腈（AIBN）（上海試劑四廠）；磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，丙酮，硫脲（沈陽(yáng)聯(lián)邦試劑廠）；乙腈（上海陸都實(shí)業(yè)有限公司）為色譜純，其他試劑均為分析純。2.2 電泳條件壓力進(jìn)樣(0.5psi,20s)，溫度20，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，操作電壓10kV，數(shù)據(jù)采集頻率16Hz。電滲流標(biāo)記物采用硫脲和丙酮。2.3 毛細(xì)管的預(yù)處理采用文獻(xiàn)2-4的處理方法，將毛細(xì)管柱依次用稀HCl、稀NaOH沖洗30min，再用水洗至中性。氮?dú)獯蹈珊?，?0%(w/w)的-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（丙酮溶液）充滿。封口并放置24h后，用丙

6、酮清洗除去過量的-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷，再用水清洗后氮?dú)獯蹈蓚溆?。?duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行預(yù)烯基化處理，即在毛細(xì)管內(nèi)壁上鍵合上一層帶烯基官能團(tuán)的硅烷化試劑。通過硅烷化試劑的雙官能團(tuán)將毛細(xì)管內(nèi)壁上的硅羥基和原位柱柱床以化學(xué)鍵間接鍵合，達(dá)到固定柱床和盡量覆蓋管壁上能夠產(chǎn)生電滲流的硅羥基的目的。由于毛細(xì)管表面的硅羥基密度直接影響到電滲流的性質(zhì)，因此在微電滲流柱的制備過程中，毛細(xì)管的預(yù)處理效果對(duì)最終結(jié)果的影響非常大。2.4 整體柱的制備參考文獻(xiàn)59的方法制備整體柱。將雙甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、不同配比的二元或三元致孔劑混合，充入經(jīng)雙官能團(tuán)試劑處理過的毛細(xì)管中。由偶氮二異丁腈（0.3%w/w）引

7、發(fā)聚合反應(yīng)，在60下反應(yīng)20h。將聚合完成后的毛細(xì)管柱取出后切去兩端，用乙腈沖洗，洗去柱內(nèi)致孔劑和殘余的反應(yīng)試劑。更換流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)先用流動(dòng)相沖洗30min，再用分離電壓平衡10min后進(jìn)行測(cè)定。3 結(jié)果與討論3.1采用二元與三元致孔劑制備的原位柱的性能對(duì)比由于所要制備的原位柱由不能夠解離的BMA和EDMA共聚而成，未加入產(chǎn)生電荷的電滲流產(chǎn)生劑，孔表面不帶電荷，電滲流只能夠通過柱管表面的殘余硅羥基產(chǎn)生，從而得到極小電滲流的分離柱。在三元致孔劑中水是用來溶解作為電滲流產(chǎn)生劑的帶電有機(jī)聚合單體的溶劑，而制備微電滲流柱時(shí)無須加入電滲流產(chǎn)生劑，因此可以將三元致孔劑簡(jiǎn)化為二元。通過改變致孔劑的比例得到不同

8、孔徑大小和孔分布的微電滲流整體柱。聚合反應(yīng)完成后，多孔聚合物充滿了毛細(xì)管通道，其端面掃描電鏡圖如圖1、2所示。由圖可以看出，雖然正丙醇的比例相同，但是由于致孔劑的組成不同，三元致孔劑中水由1，4-丁二醇代替后，所得到的聚合物呈小顆粒形成的團(tuán)狀。與三元致孔劑所得柱床相比較具有不同的孔徑分布、孔結(jié)構(gòu)和比表面積，導(dǎo)致電滲流的不同，甚至可能影響分離過程中溶質(zhì)和固定相之間的相互作用。圖1 三元致孔劑（56%正丙醇）制備原位柱掃描電鏡圖（5000倍）圖2 二元致孔劑（56%正丙醇）制備原位柱掃描電鏡圖（5000倍）不同致孔劑配比所制備的原位柱電滲流情況如圖3所示。由圖3可以看出，對(duì)于采用三元和二元致孔劑制

9、備的原位柱，隨著致孔劑中正丙醇比例的增加，電滲流都逐漸減小，但減小的趨勢(shì)逐漸減緩，這可能是聚合物柱床的孔徑變化造成的。這是由于隨著正丙醇比例的增加，聚合物孔徑變小，比表面積增大，因而柱內(nèi)管壁上的硅羥基位點(diǎn)密度變小，進(jìn)一步導(dǎo)致電滲流減小。當(dāng)正丙醇比例達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，毛細(xì)管內(nèi)表面的硅羥基已基本全部被覆蓋，所以電滲流減小的趨勢(shì)相應(yīng)減緩。另外隨著孔徑的減小，毛細(xì)管柱內(nèi)阻力增大也會(huì)導(dǎo)致電滲流的減小。然而柱床孔徑的減小，會(huì)導(dǎo)致通透性下降，操作困難，同時(shí)測(cè)量電滲流需要的時(shí)間較長(zhǎng)，誤差增大。 圖3 三元和二元致孔劑中正丙醇比例對(duì)電滲流的影響（柱：75m i.d.×20cm/27cm；流動(dòng)相：乙腈/水

10、=80:20（V/V），1.0 mmol/L；磷酸緩沖溶液，pH 9.8；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm；電壓：10kV。）3.2柱長(zhǎng)對(duì)電滲流的影響根據(jù)雙電層理論，電滲流的大小與柱長(zhǎng)無關(guān)。相同分離條件下，正丙醇含量為48%（w/w）二元致孔劑制備的原位柱，柱長(zhǎng)為20cm和40cm（有效長(zhǎng)度分別為27cm和47cm）的毛細(xì)管柱電滲流分別為33.1×10-10m2v-1s-1和30.8×10-10m2v-1s-1。這進(jìn)一步證實(shí)了相同條件下電滲流大小與柱長(zhǎng)基本無關(guān)。電滲流標(biāo)記物的遷移時(shí)間與柱長(zhǎng)成正比。盡管長(zhǎng)柱的分離能力強(qiáng)，樣品負(fù)載大，但是對(duì)于普通的填充柱來說柱長(zhǎng)的增加會(huì)導(dǎo)致反壓增大，清

11、洗困難。然而原位柱具有良好的通透性，使用長(zhǎng)柱，可以獲得較高的柱效。3.3毛細(xì)管內(nèi)徑與電滲流的關(guān)系理論研究表明，電滲流與電勢(shì)成正比。在其它條件不變的情況下，電勢(shì)也正比于毛細(xì)管壁表面上的電荷密度。不同內(nèi)徑毛細(xì)管柱（含56%w/w正丙醇的二元致孔劑制備）的電滲流情況如圖4所示，電滲流在11.55×10-10 m2v-1s-1-13.27×10-10 m2v-1s-1范圍內(nèi)變化。這說明不同管徑的毛細(xì)管所制備的原位柱電滲流基本相同。 圖4 毛細(xì)管半徑對(duì)電滲流的影響（柱：75m i.d.×20cm/27cm，二元致孔劑含56%正丙醇，34%1，4-丁二醇；流動(dòng)相：乙腈/水=8

12、0:20（V/V），0.4 mmol/L磷酸緩沖溶液，pH 9.8；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm；電壓：10kV。）電泳過程中，熱效應(yīng)是影響分離的一個(gè)重要因素。一般來說管徑越大，沿管徑的溫度梯度越大，焦耳熱的影響越大。毛細(xì)管中心和管壁之間的熱梯度與半徑的平方成正比，同樣電壓下，毛細(xì)管孔徑越小，電流越小，產(chǎn)生的焦耳熱越小，表面積與體積的比越大，散熱效果越好。管徑增大，徑向熱梯度急劇增大，分離度下降。由圖5可以看出管徑在50mm-100mm范圍內(nèi)，電流的增加并不顯著，而隨著管徑的繼續(xù)增大，電流顯著增加。這一結(jié)論與毛細(xì)管區(qū)帶電泳的規(guī)律一致。但是由于聚合物的散熱性能較差，毛細(xì)管的內(nèi)徑大于100mm時(shí)，溫度

13、梯度的影響已十分明顯，因此一般只能采用內(nèi)徑50mm 和75mm的毛細(xì)管柱。圖5 毛細(xì)管內(nèi)徑與電流的關(guān)系（柱：75m i.d.×20cm/27cm，二元致孔劑含56%正丙醇34%1,4-丁二醇；流動(dòng)相：乙腈/水=80:20（V/V），1.0mmol/L磷酸緩沖溶液，pH 9.8；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm；電壓：10kV。）3.4 重復(fù)性與應(yīng)用 電滲流測(cè)定結(jié)果表明同一批次和不同批次的微電滲流原位柱電滲流相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別小于4%和7%，重復(fù)性另人滿意。 此類微電滲流柱在電色譜中主要應(yīng)用于帶電樣品的分離。由于固定相不帶電荷，減少了溶質(zhì)和固定相之間的非特異性相互作用，但是除了電場(chǎng)中的電泳遷移外，溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配作用仍然存在。圖6是使用此種微電滲流柱在電泳驅(qū)動(dòng)下分離六種酸性化合物的分離譜圖。從圖中可以看出，六種酸性化合物在7min內(nèi)達(dá)到基線分離。圖6 六種酸性化合物的電色譜分離譜圖4 結(jié) 語(yǔ)采用二元致孔劑原位聚合的方法合成了一種新型微電滲流毛細(xì)管電泳原位柱。與三元致孔劑的方法