二元致孔劑微電滲流電泳柱的制備及性能考察

1、二元致孔劑微電滲流電泳柱的制備及性能考察項目完成單位：國家色譜研究分析中心項目完成人：張凌怡 平貴臣 張麗華 張維冰 張玉奎摘 要 采用二元致孔劑原位聚合的方法合成了一種新型微電滲流毛細管電泳原位柱。與三元致孔劑的方法相比，它具有制備過程簡單、重復性好以及柱床的孔徑和孔結構易于調(diào)節(jié)等特點。得到的毛細管柱內(nèi)部結構均勻，通透性好。系統(tǒng)地研究了各種參數(shù)對孔結構及電滲流的影響，結果表明制備的原位柱在較大pH值和有機改性劑濃度條件下，電滲流均能保持在較低值，可以適應不同電泳分離模式的需要。關鍵詞 原位聚合；微電滲流毛細管柱；致孔劑；電滲流1 引 言整體材料是近年來發(fā)展起來的一種新型分離介質(zhì)，已被應用于色

2、譜、毛細管電泳等多種分離模式，被譽為第四代填料1?；谶@種材料的原位柱技術已引起色譜工作者的廣泛關注。原位柱分為聚合物原位柱2-19和硅膠原位柱20兩類。聚合物原位柱在制備時選材范圍廣，可以使分離柱具有不同的選擇性，并且適用的pH范圍寬。較傳統(tǒng)填充柱和開管柱具有諸多明顯的優(yōu)點。聚合物原位柱的制備通常是將單體、引發(fā)劑、致孔劑和電滲流產(chǎn)生劑等混合后置入內(nèi)表面經(jīng)過處理的毛細管中。在適當條件下引發(fā)反應，使其在毛細管內(nèi)形成具有一定孔結構的整體床層，作為分離介質(zhì)實現(xiàn)對不同性質(zhì)樣品的分離分析。然而電滲流的存在可能對分離產(chǎn)生負面影響。例如，在毛細管等電聚焦中，電滲流是導致聚焦區(qū)帶展寬的主要原因之一。微電滲流整

3、體柱是最近才提出的一種新型分離柱。2001年Wu等15在Anal. Chem.上發(fā)表了第一篇相關的研究論文，之后他們又對此作了系列的研究工作16-18。實際上，微電滲流柱即是在原來正常整體柱的基礎上，在制備過程中不加入相應的電滲流產(chǎn)生劑而得到的具有特殊孔結構和表面性質(zhì)的分離柱。我們最近的研究也表明19這種柱具有多種功能，可應用于毛細管區(qū)帶電泳、毛細管電色譜、毛細管等電聚焦等多種分離模式。在正常整體柱的制備過程中，通常采用包括水在內(nèi)的三元致孔劑。其中，水主要作為電滲流產(chǎn)生劑的載體。盡管微電滲流柱仍沿用一般整體柱的制備方法，但在制備過程中水的作用已無意義。同時由于水的強極性和可形成氫鍵的性質(zhì)也可能

4、會對微電滲流柱的功能產(chǎn)生影響。本文設計了一種采用無水的二元致孔劑制備微電滲流柱的方法。與三元致孔劑的方法相比，具有制備過程簡單、重復性好的優(yōu)點。此外，還能夠通過調(diào)節(jié)致孔劑配比方便地改變柱床的孔徑和孔結構。2 實驗部分2.1 儀器與試劑Beckman P/ACE System 5010毛細管電泳儀（Beckman公司，美國）；熔融石英毛細管27cm（有效長度20cm）×75µm i.d.×375µm o.d.(河北永年光導纖維廠)。甲基丙烯酸丁酯（BMA），乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA），1，4-丁二醇（Fluka化學公司）；-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅

5、烷正丙醇（MAPS） (Acros化學公司)；正丙醇（天津博迪化學試劑公司），偶氮二異丁腈（AIBN）（上海試劑四廠）；磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，丙酮，硫脲（沈陽聯(lián)邦試劑廠）；乙腈（上海陸都實業(yè)有限公司）為色譜純，其他試劑均為分析純。2.2 電泳條件壓力進樣(0.5psi,20s)，溫度20，檢測波長214nm，操作電壓10kV，數(shù)據(jù)采集頻率16Hz。電滲流標記物采用硫脲和丙酮。2.3 毛細管的預處理采用文獻2-4的處理方法，將毛細管柱依次用稀HCl、稀NaOH沖洗30min，再用水洗至中性。氮氣吹干后，用30%(w/w)的-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（丙酮溶液）充滿。封口并放置24h后，用丙

6、酮清洗除去過量的-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷，再用水清洗后氮氣吹干備用。對毛細管內(nèi)壁進行預烯基化處理，即在毛細管內(nèi)壁上鍵合上一層帶烯基官能團的硅烷化試劑。通過硅烷化試劑的雙官能團將毛細管內(nèi)壁上的硅羥基和原位柱柱床以化學鍵間接鍵合，達到固定柱床和盡量覆蓋管壁上能夠產(chǎn)生電滲流的硅羥基的目的。由于毛細管表面的硅羥基密度直接影響到電滲流的性質(zhì)，因此在微電滲流柱的制備過程中，毛細管的預處理效果對最終結果的影響非常大。2.4 整體柱的制備參考文獻59的方法制備整體柱。將雙甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、不同配比的二元或三元致孔劑混合，充入經(jīng)雙官能團試劑處理過的毛細管中。由偶氮二異丁腈（0.3%w/w）引

7、發(fā)聚合反應，在60下反應20h。將聚合完成后的毛細管柱取出后切去兩端，用乙腈沖洗，洗去柱內(nèi)致孔劑和殘余的反應試劑。更換流動相時，應先用流動相沖洗30min，再用分離電壓平衡10min后進行測定。3 結果與討論3.1采用二元與三元致孔劑制備的原位柱的性能對比由于所要制備的原位柱由不能夠解離的BMA和EDMA共聚而成，未加入產(chǎn)生電荷的電滲流產(chǎn)生劑，孔表面不帶電荷，電滲流只能夠通過柱管表面的殘余硅羥基產(chǎn)生，從而得到極小電滲流的分離柱。在三元致孔劑中水是用來溶解作為電滲流產(chǎn)生劑的帶電有機聚合單體的溶劑，而制備微電滲流柱時無須加入電滲流產(chǎn)生劑，因此可以將三元致孔劑簡化為二元。通過改變致孔劑的比例得到不同

8、孔徑大小和孔分布的微電滲流整體柱。聚合反應完成后，多孔聚合物充滿了毛細管通道，其端面掃描電鏡圖如圖1、2所示。由圖可以看出，雖然正丙醇的比例相同，但是由于致孔劑的組成不同，三元致孔劑中水由1，4-丁二醇代替后，所得到的聚合物呈小顆粒形成的團狀。與三元致孔劑所得柱床相比較具有不同的孔徑分布、孔結構和比表面積，導致電滲流的不同，甚至可能影響分離過程中溶質(zhì)和固定相之間的相互作用。圖1 三元致孔劑（56%正丙醇）制備原位柱掃描電鏡圖（5000倍）圖2 二元致孔劑（56%正丙醇）制備原位柱掃描電鏡圖（5000倍）不同致孔劑配比所制備的原位柱電滲流情況如圖3所示。由圖3可以看出，對于采用三元和二元致孔劑制

9、備的原位柱，隨著致孔劑中正丙醇比例的增加，電滲流都逐漸減小，但減小的趨勢逐漸減緩，這可能是聚合物柱床的孔徑變化造成的。這是由于隨著正丙醇比例的增加，聚合物孔徑變小，比表面積增大，因而柱內(nèi)管壁上的硅羥基位點密度變小，進一步導致電滲流減小。當正丙醇比例達到一定數(shù)值時，毛細管內(nèi)表面的硅羥基已基本全部被覆蓋，所以電滲流減小的趨勢相應減緩。另外隨著孔徑的減小，毛細管柱內(nèi)阻力增大也會導致電滲流的減小。然而柱床孔徑的減小，會導致通透性下降，操作困難，同時測量電滲流需要的時間較長，誤差增大。 圖3 三元和二元致孔劑中正丙醇比例對電滲流的影響（柱：75m i.d.×20cm/27cm；流動相：乙腈/水

10、=80:20（V/V），1.0 mmol/L；磷酸緩沖溶液，pH 9.8；紫外檢測波長：214nm；電壓：10kV。）3.2柱長對電滲流的影響根據(jù)雙電層理論，電滲流的大小與柱長無關。相同分離條件下，正丙醇含量為48%（w/w）二元致孔劑制備的原位柱，柱長為20cm和40cm（有效長度分別為27cm和47cm）的毛細管柱電滲流分別為33.1×10-10m2v-1s-1和30.8×10-10m2v-1s-1。這進一步證實了相同條件下電滲流大小與柱長基本無關。電滲流標記物的遷移時間與柱長成正比。盡管長柱的分離能力強，樣品負載大，但是對于普通的填充柱來說柱長的增加會導致反壓增大，清

11、洗困難。然而原位柱具有良好的通透性，使用長柱，可以獲得較高的柱效。3.3毛細管內(nèi)徑與電滲流的關系理論研究表明，電滲流與電勢成正比。在其它條件不變的情況下，電勢也正比于毛細管壁表面上的電荷密度。不同內(nèi)徑毛細管柱（含56%w/w正丙醇的二元致孔劑制備）的電滲流情況如圖4所示，電滲流在11.55×10-10 m2v-1s-1-13.27×10-10 m2v-1s-1范圍內(nèi)變化。這說明不同管徑的毛細管所制備的原位柱電滲流基本相同。 圖4 毛細管半徑對電滲流的影響（柱：75m i.d.×20cm/27cm，二元致孔劑含56%正丙醇，34%1，4-丁二醇；流動相：乙腈/水=8

12、0:20（V/V），0.4 mmol/L磷酸緩沖溶液，pH 9.8；紫外檢測波長：214nm；電壓：10kV。）電泳過程中，熱效應是影響分離的一個重要因素。一般來說管徑越大，沿管徑的溫度梯度越大，焦耳熱的影響越大。毛細管中心和管壁之間的熱梯度與半徑的平方成正比，同樣電壓下，毛細管孔徑越小，電流越小，產(chǎn)生的焦耳熱越小，表面積與體積的比越大，散熱效果越好。管徑增大，徑向熱梯度急劇增大，分離度下降。由圖5可以看出管徑在50mm-100mm范圍內(nèi)，電流的增加并不顯著，而隨著管徑的繼續(xù)增大，電流顯著增加。這一結論與毛細管區(qū)帶電泳的規(guī)律一致。但是由于聚合物的散熱性能較差，毛細管的內(nèi)徑大于100mm時，溫度

13、梯度的影響已十分明顯，因此一般只能采用內(nèi)徑50mm 和75mm的毛細管柱。圖5 毛細管內(nèi)徑與電流的關系（柱：75m i.d.×20cm/27cm，二元致孔劑含56%正丙醇34%1,4-丁二醇；流動相：乙腈/水=80:20（V/V），1.0mmol/L磷酸緩沖溶液，pH 9.8；紫外檢測波長：214nm；電壓：10kV。）3.4 重復性與應用 電滲流測定結果表明同一批次和不同批次的微電滲流原位柱電滲流相對標準偏差分別小于4%和7%，重復性另人滿意。 此類微電滲流柱在電色譜中主要應用于帶電樣品的分離。由于固定相不帶電荷，減少了溶質(zhì)和固定相之間的非特異性相互作用，但是除了電場中的電泳遷移外，溶質(zhì)在固定相和流動相之間的分配作用仍然存在。圖6是使用此種微電滲流柱在電泳驅(qū)動下分離六種酸性化合物的分離譜圖。從圖中可以看出，六種酸性化合物在7min內(nèi)達到基線分離。圖6 六種酸性化合物的電色譜分離譜圖4 結 語采用二元致孔劑原位聚合的方法合成了一種新型微電滲流毛細管電泳原位柱。與三元致孔劑的方法