α-硫辛酸對(duì)大鼠肝缺血再灌注后缺血型膽道病變防治作用的實(shí)驗(yàn)研究

1、-硫辛酸對(duì)大鼠肝缺血再灌注后缺血型膽道病變防治作用的實(shí)驗(yàn)研究         10-09-03 14:46:00     作者：黎一鳴李華姜維明    編輯：studa20【摘要】  目的：探討大鼠肝缺血再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）后缺血型膽道病變的發(fā)生機(jī)制及-硫辛酸（alpha-lipoic acid, -LA）對(duì)其的防治作用。方法：成年健康雄性SD大鼠90只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（N組）、I/

2、R組、-LA處理組（LA組），建立全肝缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury, IRI）模型。檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（-glutamyl transferase，GGT）、總膽紅素（total bilirubin, TBIL）水平；電子顯微鏡觀察膽小管變化；FITC-Phalloidin顯示膽小管F-actin微絲的分布變化，激光共聚焦顯微鏡采集圖像并定量分析。結(jié)果：I/R組血清ALT、AST、GGT和TBIL水平與N組相比明顯升高（P<0.05），LA組血清ALT、AST、GGT和TBIL水平與I

3、/R組相比明顯降低（P<0.05）。F-actin熒光變化和電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)改變相符，I/R各組F-actin熒光染色紊亂、減弱，強(qiáng)度明顯低于N組（P<0.05）；膽小管微絨毛大量脫落，管腔擴(kuò)張。LA組病理改變較輕，F(xiàn)-actin熒光染色減弱，但程度較I/R組輕，熒光紊亂不甚明顯，平均熒光強(qiáng)度高于I/R組（P<0.05）；膽小管微絨毛部分脫落，管腔擴(kuò)張亦不明顯。結(jié)論：肝臟I/R可造成膽小管F-actin微絲破壞、微絨毛喪失，導(dǎo)致膽小管收縮減弱，膽汁排泄功能受損，這可能是大鼠肝臟I/ R后缺血型膽道病變發(fā)生的主要機(jī)制；-硫辛酸通過(guò)清除氧自由基，降低脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧

4、化劑-抗氧化劑的含量，保護(hù)膽小管F-actin微絲結(jié)構(gòu)免遭缺血再灌注損傷破壞，進(jìn)而預(yù)防和治療缺血型膽道病變。 【關(guān)鍵詞】  -硫辛酸·再灌注損傷·缺血型膽道病變·肌動(dòng)蛋白類    【ABSTRACT】 Objective: To investigate the mechanism of ischemic type biliary lesion after ischemia-reperfusion（I/R）in rat liver and the role of -lipoic acid in the prevention a

5、nd treatment. Methods: Ninety Sprague Dawley rats were divided randomly into three groups: normal control （N）, ischemia reperfusion （I/R） and alpha-lipoic acid pretreatment （LA） groups. The model of rat hepatic ischemia-reperfusion was established. The activity of serum ALT、AST、-GGT and TBIL were me

6、asured. The changes of bile canaliculus were observed by transmission electron microscope. The modification of F-actin microfilaments was quantified using FITC-Phalloidin and analysised by confocal laser scanning microscopy （CLSM）. Results: The ALT、AST、-GGT and TBIL levels of the ischemia reperfusio

7、n group was significantly increased （P<0.05）, while the alpha-lipoic acid pretreatment group was significantly decreased （P<0.05） compared with the normal control group. Bile canalicular F-actin was destroyed after reperfusion and this modification of F-actin staining was consistent with the o

8、bservation by transmission electron microscopy. The staining of F-actin in the ischemia reperfusion group was decreased significantly （P<0.05） compared with the normal control group. There was a marked loss of canalicular microvilli and distension of canalicular lumen in the ischemia reperfusion

9、group. The staining of F-actin in the LA group was significantly increased than those in the I/R group （P<0.05）. Conclusions: Ischemia reperfusion induces an disruption of bile canalicular F-actin microfilaments and a loss of microvilli. Alpha-lipoic acid can protect bile canalicular F-actin micr

10、ofilaments against IRI.    【KEY WORDS】 Alpha-lipoic acid·Reperfusion injury·Ischemic type biliary lesion·Actins    肝臟缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury, IRI）是導(dǎo)致缺血型膽道病變最重要的原因之一1，其機(jī)制尚未完全了解。F-actin微絲沿質(zhì)膜分布，尤其在膽小管區(qū)域，對(duì)膽小管收縮引起膽汁排泄起重要作用2。-硫辛酸（alpha-lipoic acid,

11、-LA）是已知天然抗氧化劑中效果最強(qiáng)的一種，已有國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，-硫辛酸在肝IRI中，對(duì)肝細(xì)胞具有保護(hù)作用3，但-LA對(duì)肝IRI后缺血型膽道病變的防治作用，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見報(bào)道。本研究在大鼠全肝缺血再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）模型的基礎(chǔ)上，以膽小管F-actin微絲為研究靶點(diǎn)，以-LA為干預(yù)措施，結(jié)合血清淤膽指標(biāo)，研究肝I/R后膽小管F-actin微絲的變化以及-LA在肝IRI中對(duì)膽小管F-actin微絲是否具有保護(hù)作用，以期探討-LA在預(yù)防肝I/R后缺血型膽道病變發(fā)生的保護(hù)機(jī)制，為防治肝I/R后缺血型膽道病變提供理論依據(jù)及新的途徑，為-LA應(yīng)用于臨床提供事實(shí)及理

12、論依據(jù)。    1材料與方法    1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性SD大鼠90只，68周齡，體質(zhì)量200250 g，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。90只大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組（N組）、I/R組及-LA處理組（LA組）3組，每組30只，并按I/R不同時(shí)相分為I/R 2、6和24 h 3個(gè)亞組，每個(gè)亞組各10只。    1.2主要儀器與設(shè)備異硫氫胍熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（FITCPhalloidin）和抗熒光衰減封片劑均購(gòu)自Alexis公司。透射式電子顯微鏡（日立HITACHI公司H-600），由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院

13、電子顯微鏡中心提供。激光共聚焦顯微鏡（型號(hào)：TCS Sp2）由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。    1.3方法    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，各組間比較用方差分析、Dunnettt檢驗(yàn)，組間方差不齊時(shí)采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2結(jié)果    2.1血清ALT、AST、GGT和TBIL水平的變化血清ALT、AST水平，I/R各組明顯升高，再灌注6 h時(shí)達(dá)最高，隨后下降，與相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)

14、N組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LA組和I/R組比較明顯下降，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但仍高于N組（P<0.05，表1）    血清GGT、TBIL水平，I/R各組明顯升高，均呈持續(xù)升高趨勢(shì)，和相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)N組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。LA各組與相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)I/R組比較均明顯下降（P<0.05），但仍高于N組（P<0.05，見表1）    22光學(xué)顯微鏡下肝組織病理改變N組肝組織形態(tài)無(wú)明顯變化，為正常肝組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。肝小葉組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞板以中央靜脈為中心向

15、四周呈放射狀排列。肝細(xì)胞胞質(zhì)嗜酸紅染，細(xì)胞核大、形圓，位于細(xì)胞中央，核膜清晰完整，核仁明顯。I/R組肝組織輕度炎性反應(yīng)，再灌注后6 h最嚴(yán)重，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，小葉間動(dòng)、靜脈結(jié)構(gòu)正常，出現(xiàn)中央靜脈與肝竇充血，部分肝竇內(nèi)皮細(xì)胞脫落，肝索無(wú)崩解。肝細(xì)胞明顯水腫，胞質(zhì)疏松、氣球樣變，可見少許肝細(xì)胞壞死，肝小葉內(nèi)有中等量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。LA組偶見散點(diǎn)狀壞死，也見肝細(xì)胞腫脹、空泡變性，但細(xì)胞完整清晰，其程度、范圍均較I/R組輕。    23透射電子顯微鏡下各組膽小管的改變電子顯微鏡下可見N組正常大鼠膽小管橫切面的形態(tài)外觀，管腔面微絨毛豐富，肌動(dòng)蛋白微絲形成的微絨毛核心清晰

16、可見，膽小管周圍的肝細(xì)胞膜形成緊密連接、橋粒等連接復(fù)合體封閉膽小管（圖1 A）。I/R組多數(shù)肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)呈團(tuán)塊狀凝集、邊集，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體明顯腫脹，體積增大，數(shù)量增多，線粒體嵴溶解、消失呈均質(zhì)狀，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略有擴(kuò)張，數(shù)量減少，偶見凋亡的肝細(xì)胞及凋亡小體，膽小管形態(tài)明顯改變，管腔擴(kuò)張，腔面微絨毛脫落、減少，腔內(nèi)可見膽汁淤積，其連接結(jié)構(gòu)不清晰（圖1 B）。LA組肝細(xì)胞基本正常，結(jié)構(gòu)不如N組清晰，細(xì)胞核基本呈圓形，核內(nèi)染色質(zhì)輕度凝集，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，線粒體輕度腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈層狀分布，附著的核糖體可見，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)還可見到少量脂滴，膽小管細(xì)長(zhǎng)，管腔擴(kuò)張不明顯，腔面微絨毛豐富，腔內(nèi)未見膽汁淤積，其緊密連接結(jié)構(gòu)基本清晰（圖1 C）。    24F-actin的分布變化N組可見F-actin的熒光染色沿肝細(xì)胞基底膜和膽小管膜分布，F(xiàn)-actin在膽小管橫切面呈明亮的小點(diǎn)狀熒光，N組各亞組無(wú)明顯差異（圖2 A）。I/R組中2、6及24 h亞組，F(xiàn)-actin的熒光染色均明顯減弱，可見肝細(xì)胞基底膜的熒光紊亂，膽小管膜的熒光強(qiáng)度也大大減弱，代表膽小管F-actin的小點(diǎn)狀熒光減少、甚至消失（圖2 B）。LA組中2h、6h及24h亞組，F(xiàn)-actin熒光