實(shí)訓(xùn)三胰蛋白酶的制備及活力的測(cè)定

1、實(shí)訓(xùn)三 胰蛋白酶的制備及活力的測(cè)定 目的要求1學(xué)習(xí)胰蛋白酶的純化及其結(jié)晶的基本方法。2了解酶的活性與比活性的概念。實(shí)驗(yàn)原理胰蛋白酶是以無(wú)活性的酶原形式存在于動(dòng)物胰臟中，在Ca2+的存在下，被腸激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，從肽鏈N端賴氨酸和異亮氨酸殘基之間的肽鍵斷開(kāi)，失去一段六肽，分子構(gòu)象發(fā)生一定改變后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌?。胰蛋白酶原的分子量約為24000，其等電點(diǎn)約為pH8.9，胰蛋白酶的分子量與其酶原接近（23300），其等電點(diǎn)約為pH10.8，最適pH7.68.0，在pH=3時(shí)最穩(wěn)定，低于此pH時(shí)，胰蛋白酶易變性，在pH>5時(shí)易自溶。Ca2+離子對(duì)胰蛋白酶有穩(wěn)定作用。重金屬離子

2、，有機(jī)磷化合物和反應(yīng)物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰臟、卵清和豆類植物的種子中都存在著蛋白酶抑制劑。最近發(fā)現(xiàn)在一些植物的塊基（如土豆、白薯、芋頭等）中也存在有胰蛋白酶抑制劑。胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對(duì)于由堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現(xiàn)為對(duì)堿性氨基酸一端的選擇。胰蛋白酶對(duì)這些鍵的敏感性次序?yàn)椋乎ユI> 酰胺鍵> 肽鍵。因此可利用含有這些鍵的酰胺或酯類化合物作為底物來(lái)測(cè)定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-對(duì)硝基苯胺（簡(jiǎn)稱BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-萘酰胺（簡(jiǎn)

3、稱BANA）測(cè)定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（簡(jiǎn)稱BAEE）和對(duì)甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（簡(jiǎn)稱TAME）測(cè)定酯酶活力。本實(shí)驗(yàn)以BAEE為底物，用紫外吸收法測(cè)定胰蛋白酶活力。酶活力單位的規(guī)定常因底物及測(cè)定方法而異。從動(dòng)物胰臟中提取胰蛋白酶時(shí)，一般是用稀酸溶液將胰腺細(xì)胞中含有的酶原提取出來(lái)，然后再根據(jù)等電點(diǎn)沉淀的原理，調(diào)節(jié)pH以沉淀除去大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級(jí)鹽析將胰蛋白酶原等（包括大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級(jí)鹽析將胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和彈性蛋白酶原）沉淀析出。經(jīng)溶解后，以極少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌福拥鞍酌负?/p>

4、彈性蛋白酶同時(shí)也被激活），被激活的酶溶液再以鹽析分級(jí)的方法除去糜蛋白酶及彈性蛋白酶等組分。收集含胰蛋白酶的級(jí)分，并用結(jié)晶法進(jìn)一步分離純化。一般經(jīng)過(guò)23次結(jié)晶后，可獲得相當(dāng)純的胰蛋白酶，其比活力可達(dá)到800010000BAEE單位/毫克蛋白，或更高。如需制備更純的制劑，可用上述酶溶液通過(guò)親和層析方法純化。試劑和器材1試劑（1）pH2.5乙酸酸化水。（2）2.5mol/L H2SO4。（3）5 mol/L NaOH。（4）2 mol/L NaOH。（5）2mol/L HCl。（6）0.001M HCl。（7）硫酸銨。（8）氯化鈣。（9）0.8 mol/L pH9.0硼酸緩沖液：取20ml 0.8

5、mol/L硼酸溶液，加80ml 0.2 mol/L四硼酸鈉溶液，混合后，用pH計(jì)檢查校正。（10）0.4 mol/L pH9.0硼酸緩沖液（用0.8 mol/L稀釋1倍即可）；（11）0.2 mol/L pH8.0硼酸緩沖液：取70ml 0.2 mol/L硼酸溶液，加30ml 0.5 mol/L四硼酸鈉溶液，混合后，用pH計(jì)校正。（12）0.05 mol/L pH8.0 TrisHCl 緩沖液：取50mL 0.1 mol/LTris加29.2 mL mol/L HCl 加水定容至100mL。（13）底物溶液的配制：即每毫升0.05 mol/L pH8.0 TrisHCl 緩沖液中加0.34mg

6、BAEE和2.22mg的氯化鈣。2、器材（1）新鮮或冰凍豬胰臟（2）食品加工機(jī)和高速分散器。（3）研缽。（4）大玻璃漏斗。（5）布氏漏斗。（6）抽濾瓶。（7）紗布。（8）恒溫水浴。（9）紫外分光光度計(jì)。（10）秒表。（11）pH試紙。操作方法1豬胰蛋白酶制備（1）豬胰蛋白酶原的提取豬胰臟1.0Kg（新鮮的或殺后立即冷藏的），除去脂肪和結(jié)締組織后，絞碎。 加入2倍體積預(yù)冷的乙酸酸化水（pH2.5）于1015攪拌提取24小時(shí)，四層紗 布過(guò)濾得乳白色濾液，用2.5M H2SO4調(diào)pH至2.53.0，放置34小時(shí)后用折迭濾紙過(guò)濾得黃色透明濾液（約1.5L）。加入固體硫酸銨（予先研細(xì)），使溶液達(dá)0.75

7、飽和度（每升濾液加492克）放置過(guò) 夜后抽濾（擠壓干），得豬胰蛋白酶原粗制品。（2）胰蛋白酶原激活向胰蛋白酶原粗制品濾餅分次加入10倍體積（按餅重計(jì)）冷的蒸餾水，使濾餅溶 解，得胰蛋白酶原溶液。將研細(xì)的固體無(wú)水氯化鈣慢慢加入酶原溶液中（濾餅中硫酸銨的含量按餅重的四分之一計(jì)），使Ca2+與SO42-結(jié)合后，邊加邊攪拌均勻，邊加邊攪拌，使溶液中最終仍含有0.1M CaCl2。用5M NaOH調(diào)pH至8.0，加入極少量豬胰蛋白酶（約2-5mg）輕輕攪拌，于室溫下活化810h，（23小時(shí)取樣一次，并用0.001M HCl稀釋），測(cè)定酶活性增加的情況?；罨瓿桑ㄅ哦攫B(yǎng)顏膠囊比活約35004000BAEE

8、單位）后，用2.5M H2SO4調(diào)pH至2.53.0，抽濾除去CaSO4沉淀。（3）胰蛋白酶的分離將已激活的胰蛋白酶溶液按242g/L加入細(xì)粉狀固體硫酸銨，使溶液達(dá)到0.4飽和度，放置數(shù)小時(shí)后，抽濾，棄去濾餅。2濾液按250g/L加入研細(xì)的硫酸銨，使溶液飽度達(dá)到0.75，放置數(shù)小時(shí)，抽濾，棄去濾液。（4）胰蛋白酶的結(jié)晶將上述胰蛋白酶濾餅（粗胰蛋白酶）溶解后進(jìn)行結(jié)晶：按每克濾餅溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸緩沖液的量計(jì)加入緩沖液，小心攪拌溶解。用2M NaOH調(diào)pH至8.0，注意要小心調(diào)節(jié)，偏酸不易結(jié)晶，偏堿易失活，存放于冰箱。放置數(shù)小時(shí)后，應(yīng)出現(xiàn)大量絮狀物，溶液逐漸變稠呈膠態(tài)，再加

9、入總體積的1/41/5的pH8.0的0.2M硼酸緩沖液，使膠態(tài)分散，必要時(shí)加入少許胰蛋白酶晶體。放置25天可得到大量胰蛋白酶結(jié)晶，待結(jié)晶析出完全時(shí)，抽濾，母液回收。（5）胰蛋白酶的重結(jié)晶將第一次結(jié)晶的胰蛋白酶產(chǎn)物進(jìn)行重結(jié)晶：用約1倍的0.025M0.8M硼酸緩沖液，至結(jié)晶酶全部溶解，取樣后，用2M NaOH調(diào)溶液pH至8.0（準(zhǔn)確）（體積過(guò)大，很難結(jié)晶），冰箱放置12天，可將大量結(jié)晶抽濾得第二次結(jié)晶產(chǎn)物(母液回收)，冰凍干燥后得重結(jié)晶的豬胰蛋白酶。2胰蛋白酶活性的測(cè)定以苯甲酰L精氨酸乙酯（英文縮寫(xiě)為BAEE）為底物，用紫外吸收法進(jìn)行測(cè)定。苯甲酰L精氨酸乙酯在波長(zhǎng)253nm下的紫外吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于苯

10、甲酰L精氨酸（英文縮寫(xiě)為BA）。在胰蛋白酶的催化下，隨著酯鍵的水解，苯甲酰L精氨酸逐漸增多，反應(yīng)體系的紫外吸收宜隨之相應(yīng)增加。取2個(gè)光程為怎么減肚子1厘米的帶蓋石英比色杯，分別加入25予熱過(guò)的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L HCl，作為空白，校正儀器的253nm處光吸收零點(diǎn)。再在另一比色杯中加入0.2ml待測(cè)酶液（用量一般為10微克結(jié)晶的胰蛋白酶），立即混勻并記時(shí)，每半分鐘讀數(shù)一次，共讀34min?？刂艱A253/min 在0.05 0.100左右為宜。繪制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，從曲線上求出反應(yīng)起始點(diǎn)吸光度隨時(shí)間的變化率（即初速度）DA253/min。胰蛋

11、白酶活力單位的定義規(guī)定為：以BAEE為底物反應(yīng)液pH8.0，25，反應(yīng)體積3.0ml，光徑1厘米的條件下，測(cè)定DA253，每分鐘使DA253增加0.001，反應(yīng)液中所加入的酶量為一BAEE單位。胰蛋白酶溶液的活力單位（BAEE單位/ mL）胰蛋白酶比活力（BAEE單位 / mg ）注意事項(xiàng) 1胰臟必需是剛屠宰的新鮮組織或立即低溫存放的，否則可能因組織自溶而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。2在室溫1420條件下812h可激活完全，激活時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因酶本身自溶而會(huì)使比活降低，比活性達(dá)到“30004000BAEE單位/mg蛋白”時(shí)即可停止激活。3要想獲得胰蛋白酶結(jié)晶，在進(jìn)行結(jié)晶時(shí)應(yīng)十分細(xì)心地按規(guī)定條件操作，切勿粗心大意，前幾步的分離純化效果愈好，則培養(yǎng)結(jié)晶也較容易，因此每一步操作都要嚴(yán)格。酶蛋白溶液過(guò)稀難形成結(jié)晶，毛孔大怎么辦過(guò)濃則易形成無(wú)定形沉淀析出，因此，必需恰到好處，一般來(lái)說(shuō)待結(jié)晶的溶液開(kāi)始時(shí)應(yīng)略呈微渾濁狀態(tài)。4過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)影響