單克隆抗體的制備

1、A 抗體制備技術(shù)抗體制備技術(shù)1、多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動(dòng)物，可刺激機(jī)體多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對(duì)多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實(shí)際上是含有多種抗體的混合物。2、單克隆抗體（monoclonal antibodies, mAb）：由一個(gè)識(shí)別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、少或無交叉反應(yīng)性。     抗體制備技術(shù)一、多克隆抗體制備（一）免疫原的制備（二）免疫動(dòng)物（三）免疫血清的純化（四）免疫血清的鑒定（五）免疫血清的二、單克隆抗體制備（一）單

2、克隆抗體制備原理（二）單克隆抗體制備的技術(shù)要點(diǎn)（三）影響雜交瘤技術(shù)的因素（四）單克隆抗體的應(yīng)用三、基因工程抗體技術(shù)（一）人源化抗體（二）小分子抗體（三）雙特異性抗體（四）抗體庫技術(shù)一、多克隆抗體制備（一）免疫原的制備免疫原（immunogen）指能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的抗原最重要的性質(zhì)是免疫原性（immunogenicity）免疫原天然抗原、人工或合成抗原；蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸抗原；具體制備細(xì)胞性抗原、可溶性抗原、半抗原性抗原和免疫佐劑1、細(xì)胞性抗原制備：   綿羊紅細(xì)胞（SRBC）- 溶血素；   細(xì)菌- 抗菌抗體（動(dòng)物免疫

3、血清）2、可溶性抗原制備：   指蛋白質(zhì)、多糖和脂類等。作為免疫原需要由細(xì)胞的破碎、提取與純化1）細(xì)胞的破碎（物理法、化學(xué)法）2）提取與純化：超速離心分離是一種根據(jù)分離物質(zhì)的比重特點(diǎn)，通過差速或梯度密度離心，將分子大小不同的抗原顆粒分開的方法，只適宜少數(shù)大分子物質(zhì)的分離。選擇性沉淀選擇某抗原理化特性，采用相應(yīng)沉淀劑或溶液環(huán)境例50%飽和硫酸銨鹽溶液可沉淀析出學(xué)清球蛋；8%12%PEG 6000可沉淀IgG。        鹽析法沉淀抗原的機(jī)理超濾法利用孔徑大小不同的特制薄膜對(duì)不同分子大小的抗原物

4、質(zhì)進(jìn)行濾篩層析法包括凝膠過濾、離子交換、親和層析等，用于抗原等物質(zhì)的精提電泳（略）3）鑒定：     鑒定純化蛋白的含量、相對(duì)分子的質(zhì)量、     純度以及免疫學(xué)活性。凝膠過濾層析( 分子篩)的作用機(jī)理親和層析的作用機(jī)理3）鑒定：     鑒定純化蛋白的含量、相對(duì)分子的質(zhì)量、     純度以及免疫學(xué)活性。蛋白的含量定氮（紫外光280nm等）分子的質(zhì)量電泳、質(zhì)譜蛋白的純度電泳、高效液相層析免疫學(xué)活性免疫雙擴(kuò)散、免疫印跡Westernblo

5、t鑒定三株單抗的特異性1.分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.陰性對(duì)照:正常小鼠血清；3.純化后的B6與病毒上清反應(yīng)；4.純化后的G12與病毒上清反應(yīng)；5.純化后的2B12與病毒上清反應(yīng)。3、半抗原性免疫原的制備        半抗原（hapten）        蛋白質(zhì)等載體（carrier）        連接物理法：即利用電荷和微孔吸附半抗原     

6、   化學(xué)法：利用某些功能基團(tuán)把半抗原連接到載體分子上4、免疫佐劑（immunoadjuvant），佐劑   指某些物質(zhì)，因?yàn)樵擃愇镔|(zhì)與抗原物質(zhì)一起或先于注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原物質(zhì)的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。   種類無機(jī)、生物性、人工合成、油劑和納米顆粒。   用途抗原表面積增，構(gòu)型改變；延長(zhǎng)抗 原的滯留時(shí)間；增強(qiáng)吞噬（二）免疫動(dòng)物 1、免疫動(dòng)物的選擇：  抗原來源與動(dòng)物種屬的關(guān)系（越近越差） 動(dòng)物個(gè)體的選擇（年齡、體重與健康，） 抗原性質(zhì)與動(dòng)物種類2、免疫的方法：&#

7、160;  免疫原的劑量   免疫的途徑與其間隔時(shí)間   免疫動(dòng)物采血 （對(duì)實(shí)驗(yàn)成功與否至關(guān)重要）（三）免疫血清的純化1、特異性抗體的純化1）親和層析2）吸附2、IgG類抗體的純化1）鹽析2）凝膠過濾3）離子交換4）親和層析(四)免疫血清的鑒定1、抗體效價(jià)的測(cè)定（凝集、擴(kuò)散、ELISA）2、特異性的鑒定（免疫印跡、雙擴(kuò)散）3、純度的鑒定（SDS-PEAG）4、親和力的鑒定affnity指抗體與抗原結(jié)合的牢固程度，以親和常數(shù)表示。測(cè)定方法有平衡透析、ELISA、競(jìng)爭(zhēng)（非競(jìng)爭(zhēng)）結(jié)合等。  單抗親合常數(shù)的測(cè)定：?jiǎn)慰褂H合常數(shù)測(cè)定采用

8、非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫試驗(yàn)法：1）先確定在某一抗原濃度時(shí)抗體可以達(dá)到飽和；2）以該抗原濃度為實(shí)驗(yàn)條件，飽和時(shí)的OD值作為OD-100，找出OD-50時(shí)的抗體濃度和相應(yīng)的pp65抗原濃度；3)根據(jù)公式計(jì)算McAb的Ka值。t代表測(cè)定時(shí)的溫度；n=Abt/Abt；Abt表示抗原濃度較高的Amax的一半；Abt表示抗原濃度較低的Amax的一半。對(duì)于單克隆抗體，一般親合力要求>107L/mol，好的單抗多大于109 L/mol。 （五）免疫血清的保存1、4保存（6個(gè)月）2、低溫保存（-70 -20 ，5年）3、真空干燥保存（5 10年）注意點(diǎn)：保存前需經(jīng)除菌    

9、    保存液含防腐劑        避免反復(fù)凍融（分裝）        二、單克隆抗體制備單克隆抗體（monoclone antibody，McAb）是由抗原致敏的B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)克隆化培養(yǎng)后由一個(gè)細(xì)胞克隆所分泌的只識(shí)別單一抗原決定簇的純的抗體。其理化性狀高度均一，生物活性單一，高度特異及高效價(jià)特性，用于臨床實(shí)驗(yàn)室診斷與臨床疾病治療。（一）單克隆抗體制備的原理利用雜交瘤細(xì)胞具有兩種親本細(xì)胞的特性

10、即致敏B淋巴細(xì)胞分泌特異性抗體能力與骨髓瘤細(xì)胞具無限繁殖能力，從雜交瘤中經(jīng)克隆化后成為單個(gè)細(xì)胞克隆并分泌抗體，稱為單克隆抗體。制備過程致敏B淋巴細(xì)胞（免疫動(dòng)物）       雜交細(xì)胞瘤制備、篩選       雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的確認(rèn)       分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆       單克隆抗體的批量生產(chǎn)（二）單克隆抗體制備的技術(shù)

11、要點(diǎn)1、免疫動(dòng)物選擇純系Balb/c小鼠2、骨髓瘤細(xì)胞用以融合前應(yīng)經(jīng)過篩選3、細(xì)胞融合4、陽性克隆的篩選5、克隆化6、單克隆抗體的制備7、單克隆抗體的純化和鑒定8、單克隆抗體的保存（三）影響雜交瘤技術(shù)的因素1、試劑與器材  用前必須經(jīng)嚴(yán)格的篩選，尤其血清、融合劑2、培養(yǎng)技術(shù)  防止污染，細(xì)胞培養(yǎng)的嫻熟技能3、早期克隆化  避免無關(guān)細(xì)胞克隆的過度生長(zhǎng)，但又應(yīng)避免克隆細(xì)胞的丟失。（四）單克隆抗體的應(yīng)用1、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)診斷試劑   利用單抗具有的特質(zhì)-特異性與純度高，理化性均一2、蛋白質(zhì)的提純   將其作為親和層析中的重要配體3、腫瘤

12、的導(dǎo)向治療協(xié)助示蹤   三、基因工程抗體技術(shù)基因工程抗體（genetic engineering antibody）又稱重組抗體，指應(yīng)用DNA重組及蛋白工程技術(shù)對(duì)編碼抗體的基因按不同需求進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適宜的受體細(xì)胞后重新表達(dá)的抗體。包括：（一）人源化、小分子、雙價(jià)特異及抗體融合蛋白等。            （二）抗體庫技術(shù)（一）人源化抗體（humanized antibody）人源化抗體指將鼠源性單抗，通過基因克隆和DNA重組及蛋白質(zhì)工程學(xué)等技術(shù)

13、，用人源氨基酸序列取代鼠的使其保留親本鼠單抗的親和性與特異性，但降低鼠單抗的異源性利于人體內(nèi)使用。1、嵌合抗體（chimeric antibody）2、改形抗體（reshaped antibody）（二）小分子抗體小分子抗體指相對(duì)分子質(zhì)量比較小但具有抗原結(jié)合功能的分子片段。小分子抗體：抗原結(jié)合片段（Fab）、可變                        區(qū)片段（

14、Fv）等優(yōu)點(diǎn)：分子小，通透性強(qiáng)              原核細(xì)胞表達(dá)，成本低              不含F(xiàn)c段，不與帶Fc段受體反應(yīng)              半衰期短，利于及時(shí)清除  

15、;                      （三）雙特異性抗體雙特異性抗體(bispecific antibody)又稱雙功能抗體。他具有針對(duì)兩個(gè)不同抗原位點(diǎn)結(jié)合的特性，可同時(shí)與兩種不同抗原發(fā)生結(jié)合，不同于天然抗體。1、化學(xué)交聯(lián)2、細(xì)胞工程3、基因工程（四）抗體庫技術(shù)抗體庫技術(shù)是指用細(xì)菌克隆代替B細(xì)胞克隆來表達(dá)制備各種抗體（抗體譜）。   噬菌體展示(phage d

16、isplay)，即用分子克隆的方法將外源基因片段插入噬菌體殼蛋白的非必需區(qū)，該基因的表達(dá)產(chǎn)物與殼蛋白一起以融合蛋白的形式展示于噬菌體顆粒的表面。（四）抗體庫技術(shù)主要特點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速（無須細(xì)胞融合）選擇范圍廣可模擬體內(nèi)免疫系統(tǒng)反應(yīng)可直接獲得特異性人抗體規(guī)模生產(chǎn)方便1單克隆抗體的制備（一）雜交瘤細(xì)胞的大量繁殖     克隆化的細(xì)胞可以在體外進(jìn)行大量培養(yǎng)，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限，其不能超過特定的細(xì)胞濃度，且每天要換培養(yǎng)液。而體內(nèi)雜交瘤細(xì)胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細(xì)胞具有從親代淋巴細(xì)胞得來的腫瘤細(xì)胞的遺傳特性。如接種到

17、組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無胸腺的裸鼠），雜交瘤細(xì)胞就開始無限地繁殖，直至宿主死亡。產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，這種抗體的效價(jià)往往高于培養(yǎng)細(xì)胞上清液的1001 000倍。    利用免疫抑制劑，如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細(xì)胞血清等，可以加速和促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。    1材料（1）經(jīng)高壓滅菌的降植烷。（2）Balb/c鼠：58周齡。    （3）雜交瘤細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。    （4）RPMI1640培養(yǎng)液 

18、;   （5）新生牛血清    2操作方法(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后周內(nèi)種植細(xì)胞。(2) 收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，用FCS1640液洗滌一次，1 000r/min離心10min。    (3) 取樣，用臺(tái)盼蘭染色，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，重新用FCS1640液配成1.0×107細(xì)胞/ml的懸液。    (4) 給注射了降植烷的小白鼠接種雜交瘤細(xì)胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107個(gè)細(xì)胞/ml）。    (5) 接種后10

19、天左右時(shí)間腫瘤體積最大，此時(shí)可由腹腔抽取腹水，每隔13天取1次，可取10次。血清可由腋下動(dòng)脈或心臟采血后分離。    （二）單克隆抗體的提純    1材料    (1) 20mMol/L pH7.87.9TrisHCl緩沖液      20 mMol/L NaCl    (2) 20mMol/L pH7.87.9TrisHCl緩沖液      40mMol/L NaCl

20、0;   (3) 20mMol/L pH7.87.9TrisHCl緩沖液      80 mMol/L NaCl    (4) 20mMol/L pH7.87.9TrisHCl緩沖液    (5) 飽和硫酸銨液    (6) DEAE纖維素柱                  

21、一般每ml腹水中，含有總蛋白約25mg36mg。    （8）過DEAE纖維素柱：纖維素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris緩沖液平衡。透析樣品以Tris緩沖液等量稀釋。    樣品進(jìn)入柱床速度為1ml2ml/min，以NaCl線形梯度洗脫。大部分單克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脫，也有極少例外的單克隆抗體于120 mMol/L 150 mMol/L NaCl洗脫。    測(cè)OD280nm收集蛋白峰，單克隆IgG保存?zhèn)溆谩?#160;  

22、雜交瘤產(chǎn)生各種免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪種為主，則決定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多為產(chǎn)生IgM的B淋巴細(xì)胞。免疫多次的多為IgG。    （三）單克隆抗體的鑒定    1雜交瘤細(xì)胞染色體的檢查  采用秋水仙素裂解法進(jìn)行。    2單克隆抗體的類型、亞型的測(cè)定：購買兔抗小鼠Ig類型和亞型的標(biāo)準(zhǔn)抗血清，采用瓊脂擴(kuò)散法或ELISA夾心法測(cè)定單抗的Ig類型和亞型。    3單抗的特異性鑒定  可以采用各種方法，如免疫熒光法、EL

23、ISA法、間接血凝和免疫印跡技術(shù)等，同時(shí)還需做免疫阻斷試驗(yàn)等。    4單抗的效價(jià)測(cè)定  可采用凝集反應(yīng)、ELISA或放射免疫測(cè)定。不同的測(cè)定方法效價(jià)不同。培養(yǎng)上清液的效價(jià)遠(yuǎn)不如腹水的效價(jià)。采用凝集反應(yīng)，腹水效價(jià)可達(dá)5×104。而采用ELISA檢查，腹水效價(jià)可達(dá)1.0×106。單抗的效價(jià)以培養(yǎng)上清和腹水的稀釋度表示。5必要時(shí)還可以測(cè)定單抗的親和力和識(shí)別抗原表位的能力測(cè)定。2抗體的制備方法與原理單克隆抗體的制備1975年Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體

24、，又可無性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進(jìn)入了一個(gè)高度精確的新紀(jì)元。免疫細(xì)胞化學(xué)的 技術(shù)關(guān)鍵之一是制備特異性強(qiáng)、親合力大、滴度高的特異性抗體，由于每種抗原都有幾個(gè)抗原決定簇，用它免疫動(dòng)物將產(chǎn)生對(duì)各個(gè)決定簇的抗體，即多克隆抗體。單克隆抗體則是由一個(gè)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞融合而形成的雜交廇細(xì)胞經(jīng)無性繁殖而來的細(xì)胞群所產(chǎn)生的，所以它的免疫球蛋白屬同一類型，質(zhì)地純一，而且它是針對(duì)某一抗原決定簇的，因此特異性強(qiáng)，親合性也一致。單克隆抗體（McAb）的特性和常規(guī)血清抗體的特性比較見2-3。表23 單克隆抗體（McAb）和常規(guī)免疫血清抗體的特性比較項(xiàng)目常規(guī)免疫血

25、清抗體McAb抗體產(chǎn)生細(xì)胞多克隆性單克隆性抗體的結(jié)合力特異性識(shí)別多種抗原決定簇特異性識(shí)別單一抗原決定簇免疫球蛋白類別及亞類不均一性，質(zhì)地混雜同一類屬，質(zhì)地純一特異性與親合力批與批之間不同特異性高，抗體均一有效抗體含量0.010.1mg/ml（小鼠腹水）0.55.0mg/ml(小鼠腹水) 0.510.0g/ml（培養(yǎng)物上清液）用于常規(guī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)可用單抗組合應(yīng)用抗原抗體形成格子結(jié)構(gòu)（沉淀反應(yīng)）容易形成一般難形成抗原抗體反應(yīng)抗體混雜，形成2分子反應(yīng)困難，不可逆可形成2分子反應(yīng)，可逆單克隆抗體的制備方法如下。（一）動(dòng)物的選擇與免疫1動(dòng)物的選擇 純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動(dòng)范圍小，體弱，食量

26、及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實(shí)驗(yàn)室均能飼養(yǎng)成活。目前開展雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室多選用純種BALA/C小鼠。2免疫方案 選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩個(gè)月左右根據(jù)確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。初次免疫 抗原150g加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射或脾內(nèi)注射（一般0.81ml,0.2ml/點(diǎn)）3周后第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）3周后第三次免疫 劑量

27、同一，不加佐劑，ip（57天后采血測(cè)其效價(jià)）23周加強(qiáng)免疫，劑量50500g為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射）3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)抗原的反應(yīng)性。（2）顆?？乖庖咝詮?qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時(shí)要求抗原量為12×107個(gè)細(xì)胞。初次免疫 1×107/0.5ml ip23周后第二次免疫 1×

28、107/0.5ml ip3周后加強(qiáng)免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv取脾融合（二）細(xì)胞融合1細(xì)胞融合前準(zhǔn)備（1）骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用的骨髓瘤細(xì)胞系見表2-4。表2-4用于融合試驗(yàn)的主要骨髓瘤細(xì)胞系名 稱來 源耐 受 藥 物Ig鏈H LP3/X63-Ag8(X63)BALB/C骨髓瘤MOPC-218-氮鳥嘌呤r1 KP3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)P3/X63-Ag88-氮鳥嘌呤 P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)P3/X63-A

29、g88-氮鳥嘌呤 K（不分泌型）P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)（X63×BALB/C脾細(xì)胞）雜交瘤8-氮鳥嘌呤 SP2/0-Ag14(SP2/0)（X63×BALB/C脾細(xì)胞）雜交瘤8-氮鳥嘌呤 F0BALB/C骨髓瘤8-氮鳥嘌呤 S194/5.XXO.BU.1P3/X63-Ag85-溴脫氧尿嘧啶核苷 MPC11-45.6TG1.7BALB/C骨髓瘤MPC-116-巰鳥嘌呤r2b K210.RCY3.Ag1.2.3LOU大鼠骨髓瘤R2108-氮鳥嘌呤 KGM15006TG-A12人骨髓瘤GM15006-巰鳥嘌呤r1 KU-266AR人骨髓瘤U-2668-氮鳥嘌呤骨髓

30、瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%20%，細(xì)胞濃度以1045×105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中期時(shí)，可按1：31：10的比例傳代。每35天傳代一次。細(xì)胞在傳代過程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮鳥嘌呤進(jìn)行處理，使生存的細(xì)胞對(duì)HAT呈均一的敏感性。（2）飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長(zhǎng)繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入

31、飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為2×104或105細(xì)胞/孔。2細(xì)胞融合的步驟（1）制備飼養(yǎng)細(xì)胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，610周       拉頸 處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，35min用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜用無菌注射器注入56ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管）反復(fù)沖洗，吸出沖洗液沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離56mi

32、n用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/ml加入96孔板，100l/孔放入37。c CO2孵箱培養(yǎng)（2）制備免疫脾細(xì)胞最后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次計(jì)數(shù)取108脾淋巴細(xì)胞懸液備用（3）制備骨髓瘤細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)骨髓瘤細(xì)胞離心用無血清培養(yǎng)液洗2次計(jì)數(shù)，取得×107細(xì)胞備用（4）融合將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（

33、PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)。90s內(nèi)加入37預(yù)溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動(dòng)。37水浴作用90s。加37。C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。離心，800rpm, 6min。充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100l。一般一個(gè)免疫脾臟可接種4塊96孔板。將培養(yǎng)板置37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（三）選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測(cè)1HAT選擇雜交瘤細(xì)胞 脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，只有脾細(xì)

34、胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長(zhǎng)繁殖，而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長(zhǎng)繁殖。在用HAT選擇培養(yǎng)12天內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，34天后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持710天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時(shí)，即可開始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每23天換一半培養(yǎng)液。2抗體的檢測(cè) 檢測(cè)抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速

35、、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有：（1）放射免疫測(cè)定（RIA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測(cè)。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測(cè)。（3）免疫熒光試驗(yàn)適合于細(xì)胞表面抗原的McAb的檢測(cè)。（4）其它如間接血凝試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗(yàn)等。（四）雜交瘤的克隆化雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。因?yàn)榻?jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開

36、就需要克隆化。克隆化的原則是，對(duì)于檢測(cè)抗體陽性的雜交克隆盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比抗體分泌的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。克隆化的方法很多，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。1有限稀釋法克?。?）克隆前1天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層（同細(xì)胞融合）。2）將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計(jì)數(shù)。（3）調(diào)整細(xì)胞為310個(gè)細(xì)胞/ml。（4）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞100l。孵育于37、5

37、%CO2孵箱中 。（5）在第7天換液，以后每23天換液1次。（6）89天可見 細(xì)胞克隆形成，及時(shí)檢測(cè)抗體活性。（7）將陽性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。（8）每個(gè)克隆應(yīng)盡快凍存。2軟瓊脂培養(yǎng)法克?。?）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42預(yù)熱。0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42保溫。（2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養(yǎng)細(xì)胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。

38、（4）1ml 0.5%瓊脂液（42預(yù)熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。（5）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37、5%CO2孵箱中。（6）45天 后即可見針尖大小白色克隆，710天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔中進(jìn)行培養(yǎng)。（7）檢測(cè)抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。（五）雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇1雜交瘤細(xì)胞的凍存 及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊]有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。雜交瘤細(xì)胞

39、的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對(duì)原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)滿孔底時(shí)，一孔就可以裝一支安瓿凍存。細(xì)胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）。凍存液最好預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降至0后放入-70超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間。2細(xì)胞復(fù)蘇方法 將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37水浴中，在1min內(nèi)使凍存的細(xì)胞解凍，將細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗

40、滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞形成集落時(shí)，檢測(cè)抗體活性。（六）單克隆抗體的大量生產(chǎn)大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：（1）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為1060g/ml,如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。（2）體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。實(shí)體瘤法：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按13×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共24點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后（一般1020天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達(dá)到110mg/ml。但采血量有限。腹水

41、的制備：常規(guī)是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液體石蠟于BALB/C鼠，12周后腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞710天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲510ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)到510mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水塊、量多。（七）單克隆抗體的鑒定對(duì)制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的，應(yīng)做下述幾個(gè)方面的鑒定：1抗體特異性的鑒定 除用免疫原（抗

42、原）進(jìn)行抗體的檢測(cè)外，還應(yīng)該用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，方法可用ELISA、IFA法。例如：制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)該用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無交叉。2McAb的Ig類與亞類的鑒定一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時(shí)已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測(cè)出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙

43、擴(kuò)或夾心ELISA來確定。在作雙擴(kuò)試驗(yàn)時(shí)，如加入適量的PEG（3%），更有利于沉淀線的形成。3McAb中和活性的鑒定 用動(dòng)物或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來確定McAb的生物學(xué)活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感的動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，來觀察動(dòng)物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。4McAb識(shí)別抗原表位的鑒定用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，測(cè)相加指數(shù)的方法，測(cè)定McAb所識(shí)別抗原位點(diǎn)，來確定McAb的識(shí)別的表位是否相同。5McAb親合力的鑒定 用ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親合力。3單克隆抗體的制備及應(yīng)用一、單克隆抗體概念：每一克隆B細(xì)胞所產(chǎn)生的理化性狀高度均一、組

44、成均一、只與同一種抗原決定族反應(yīng)的抗體，稱為單克隆抗體（monoclonal antibody,McAb）。二、雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體流程三、單克隆抗體的基本技術(shù)1.抗原提純與動(dòng)物免疫：抗原純度高：電泳純與骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c小鼠2.細(xì)胞的選擇：   A 經(jīng)過抗原免疫的B細(xì)胞（脾細(xì)胞）。   B 腫瘤細(xì)胞(多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞:Sp2/0）。 3.細(xì)胞融合：   融合劑：聚乙二醇     (PEG,常用聚合度10002000濃度w/v：40%)   細(xì)胞比例：   1:21:10，常用1:4