不同糖尿病模型小鼠糖原代謝變化的研究

1、不同糖尿病模型小鼠糖原代謝變化的研究研究原著?6l3?中【臨末藥理學(xué)與治療學(xué)中國(guó)藥理學(xué)會(huì)主辦2005Jun;10(6):613616不同糖尿病模型小鼠糖原代謝變化的研究肖梅芳,張學(xué)梅,白香,譚煥然北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系,北京100083;大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部藥理教研室,大連116622,遼寧摘要目的:通過(guò)觀察不同類型糖尿病動(dòng)物模型糖原代謝的變化,初步探討糖原代謝異常在糖尿病發(fā)病過(guò)程中的作用方法:首先建立4種糖尿病小鼠模型:四氧嘧啶誘導(dǎo)模型,STZ誘導(dǎo)模型,n5一STZ誘導(dǎo)模型和葡萄糖激酶基因敲除模型,并對(duì)模型小鼠和肌糖原的含量,并采用Westernblot方法對(duì)葡萄糖激酶基因敲除

2、模型鼠肝組織中葡萄糖激酶的蛋白表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果:血糖檢測(cè)結(jié)果顯示各模型組空腹血糖值均顯著高于對(duì)照組,表明糖尿病造?；境晒?除n5一STZ誘導(dǎo)模型外,其它模型組肝糖原的含量均明顯低于對(duì)照組.此外,與對(duì)照組比較,4結(jié)果表明葡萄糖激酶基因敲除模型鼠肝組織中葡萄糖激酶的蛋白表達(dá)顯著降低,這可能是該模型肝糖原含量減少的機(jī)制之一.結(jié)論:糖尿病動(dòng)物模型出現(xiàn)糖原代謝異常.表現(xiàn)為肝糖原和肌糖原減少,提示糖原代謝在糖尿病發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用.關(guān)鍵詞糖原;動(dòng)物疾病模型;四氧嘧啶;鏈脲佐菌素;糖尿病;葡萄糖激酶文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):10092501(2005)06061304糖原代謝是體內(nèi)糖代謝的重要組成

3、部分,體內(nèi)體內(nèi)血糖的重要來(lái)源,當(dāng)機(jī)體需要葡萄糖或者血糖080803和2【x】2AA2l42O1)肖梅芳.女.碩士,研究方向:分子藥理學(xué)譚煥然.通訊作者,女,教授,研究方向:分子藥理學(xué)Tel:010.82802O04E.mail:,O11水平降低時(shí),它可以迅速被動(dòng)員分解入血以補(bǔ)充血糖6一磷酸酶,故肌糖原不能分解為葡萄糖來(lái)補(bǔ)充血糖,它主要為肌肉收縮提供能量糖原代謝的紊亂可能會(huì)引起血中葡萄糖濃度升高,進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病象,包括經(jīng)典的1型糖尿病模型四氧嘧啶誘導(dǎo)模型和鏈脲佐菌素(streptozotoein,STZ)誘導(dǎo)模型,以及2型糖尿病模型鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病模

4、型(n5一STZ誘導(dǎo)模型)和由本室構(gòu)建的肝臟特異性葡萄糖激酶基因敲除模型,觀察糖尿病動(dòng)物模型糖原代謝的改變,對(duì)糖原代謝在糖尿病發(fā)病過(guò)程中的作用進(jìn)行初步探討,以期為糖尿病的臨床防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù):1材料與方法1.1動(dòng)物與試劑雄性昆明小鼠,C57BL/6J小鼠和ICR小鼠,SPF(specialpathogenfree)級(jí),體重1822g,購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)20020001四氧嘧啶購(gòu)自Fluka公司(美國(guó));鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Sigma公司(美國(guó));羅氏血糖儀購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(德國(guó));兔來(lái)源的葡萄糖激酶多克隆抗體購(gòu)自Santacz公司(美國(guó));堿磷酶標(biāo)

5、記羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù);葡萄糖試劑盒(氧化酶法)購(gòu)自北京北化康泰臨床試劑;肝糖原測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供;NBT/BCIP染色試劑盒購(gòu)自華美生物工程公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.導(dǎo)模型的制備:昆明小鼠,68周,禁食12h后,以100mg?kg一次性尾靜脈注射四氧嘧啶生理鹽水.?614?高水平者作為糖尿病模型;STZ誘導(dǎo)模型的制備:C57BL/6J小鼠,68周,禁食12h后,一次性腹腔注射STZ100mg?kg體重(0.1tool?L檸檬酸鈉稀釋,1)H4.5),1周后空腹血糖高于16.7nmlol?L作為糖尿病模型鼠.注射生理鹽水作為對(duì)照組:型的建立:取5d齡ICR

6、小鼠,腹腔注射STZ100mg?kg.體重(0.1mol?L檸檬酸鈉稀釋,pH4.5),5d后再補(bǔ)注STZ60mg?kg體重小鼠斷乳后,給予正常飼料喂養(yǎng)4周后剪鼠尾采血,用羅氏血糖儀測(cè)血糖:腹腔注射等量生理鹽水作為對(duì)照組;基因敲除糖尿病模型的建立:本研究室已經(jīng)成功構(gòu)建了一種新的2型糖尿病動(dòng)物模型肝臟特異性葡萄糖激酶(glucokinase,GK)基因敲除小鼠模型,該模型的建立基于CreloxP條件性基因打靶技術(shù):首先將兩個(gè)同方向的loxP序列插入到目的基因GK外發(fā)生正確同源重組的ES細(xì)胞顯微注射入小鼠囊胚,移植入假孕雌鼠,獲得Fl代嵌和體小鼠:嵌和體小鼠進(jìn)一步雜交后得到條件打靶小鼠:將該打靶小

7、鼠與肝臟特異性表達(dá)Cre重組酶(AlbCre)的轉(zhuǎn)基因昆明小鼠雜交,得到肝臟特異性葡萄糖激酶基因敲除小鼠:以正常昆明小鼠作為對(duì)照組:1.4血糖測(cè)定小鼠禁食8h以上(不禁水),眼球后靜脈叢取血,3000r?min離心8min分離血清.參照試劑盒說(shuō)明書,用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血清中糖儀:鼠肝組織及肌肉組織中糖原的含量?糖原含量的測(cè)定采用蒽酮法.動(dòng)物脫頸椎處死,取小鼠肝組織及股四頭肌,用生理鹽水漂洗后濾紙吸干,稱重,采用糖原測(cè)定試劑盒檢測(cè)肝/肌糖原的含量葡萄糖激酶的表達(dá)小鼠脫頸椎處死,迅速取出肝臟置于液氮中,一70cc保存待用:取一小塊肝組織(200rag)加入500址l預(yù)冷的三去污裂解緩沖液(50I

8、Tu11o1.LTris,150mmol?LNaC1,0.02%疊氮鈉,0.1%SDS,l%NP.40,0.5%去氧膽酸鈉,1mmol?L一'EDTA,100mg?L一PMSF,1mg?L一Leupeptin,pH8.0),于冰上迅速勻漿,經(jīng)4cc10000×g離心10rain后,吸取上清,反復(fù)離心3遍,吸取清亮度:約取100g蛋白液加入等體積的2XLSB凝膠ChinJClinPhamlacolTher2005Jun;10(6)加樣緩沖液(100mmol?ITris,4%SDS,0.2%溴酚蘭,20%甘油,200mmol?LDTF,pH6.8),置于沸水浴中煮沸變性:經(jīng)SDS

9、聚丙烯酰胺凝膠電泳后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜,隨后用5%(w/v)脫脂奶室溫封閉12h:一抗4cc孵育過(guò)夜后TBST漂洗濾2000成像儀拍照并掃描光密度值半定量比較.1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)-4-標(biāo)準(zhǔn)差(-4-較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),各組之間顯著性比較采用單因素方差分析(onewayANOVA).2結(jié)果2.1糖尿病模型小鼠血糖的測(cè)定與對(duì)照組相比,糖尿病模型組空腹血糖值多介于1015mmol?L之間;1型糖尿病模型組血糖升高更為明顯,空腹血糖值高達(dá)30rrlol?L(圖1):模型組與各自的對(duì)照組比較均具有顯著性差異;此外1型糖尿病模型組與2型糖尿病模型組相比較也具有顯著性差異,表明造?；境?/p>

10、功,可以用于以后的實(shí)驗(yàn).二0呂目罄魯篷ABCD圖1糖尿病小鼠模型的空腹血糖濃度(.4-S,n=5)與各自對(duì)照組比較"P<0.05;與四氧嘧啶誘導(dǎo)模型組比較P<0.05;與STZ誘導(dǎo)模型組比較P<0.05;A:四氧嘧啶誘導(dǎo)模型;B:STZ誘導(dǎo)模型;C:n5一STZ誘導(dǎo)模型;D:GK基因敲除模型照組比較,四氧嘧啶誘導(dǎo)模型組和STZ誘導(dǎo)模型組糖原的含量降低了約60%,STZ誘導(dǎo)模型組降低了對(duì)照組比較,四氧嘧啶誘導(dǎo)模型組和STZ誘導(dǎo)模型組分別減少了55%和26%(表1).中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)2005Jun;10(6)表11型糖尿病動(dòng)物模型肝糖原和肌

11、糖原含量測(cè)定(i-i-S,n:5)?615?檢測(cè)結(jié)果顯示n5一STZ誘導(dǎo)模型肝糖原含量與對(duì)照組相比有減少的趨勢(shì),但是尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義肝臟特異性GK基因敲除模型的肝糖原含量則明顯低于對(duì)照組,與對(duì)照組相比減少了約90%.2個(gè)模型組比較,n5一STZ誘導(dǎo)模型和GK基因敲除模型肌糖原含量分別減少了67%和60%(表2).表22型糖尿病動(dòng)物模型肝糖原和肌糖原含量測(cè)定(±S,n=5)達(dá)用Westernblot方法檢測(cè)肝臟特異性GK基因敲除模型小鼠肝組織中葡萄糖激酶的蛋白表達(dá)量.GK基因敲除鼠肝組織中葡萄糖激酶的含量明顯減少(圖2),較對(duì)照組減少了約35%,這可能是該模型肝糖原含量減少的機(jī)制之一.?

12、皿鞠星溢鞲糖耀GK對(duì)照組K/O圖2GK基因敲除模型小鼠肝組織中葡萄糖激酶的蛋白表達(dá)情況(-i-S,n=5)3討論疾病動(dòng)物模型是研究人類疾病發(fā)病機(jī)制的重要工具.為了研究糖尿病糖原代謝的變化,我們分別構(gòu)建了1型糖尿病小鼠模型和2型糖尿病小鼠模型,包括四氧嘧啶誘導(dǎo)模型,STZ誘導(dǎo)模型,n5一STZ果表明上述4種動(dòng)物模型血糖水平均明顯高于正常值,且1型糖尿病模型的血糖濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2型糖尿病模型,約為2型的23倍,與臨床上1型和2型糖尿病患者的血糖水平相吻合,提示我們成功制備了上述糖尿病動(dòng)物模型:肌糖原合成減少或者肝糖原分解增加可以引起血糖水平的升高,導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生;反之,某些促進(jìn)糖出2型糖尿病患者肌

13、糖原含量明顯低于正常人群.此外,Bischof和krssak等人發(fā)現(xiàn)糖尿病患者們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出:不管是l型糖尿病模型,還是2型糖尿病模型,均出現(xiàn)不同程度的肝糖原和肌論是肝糖原還是肌糖原代謝,對(duì)糖尿病的發(fā)病都起著重要的作用;同時(shí)也表明糖原代謝異常在1型糖尿病和2型糖尿病的發(fā)病過(guò)程中都扮演著重要的角色.葡萄糖激酶是肝糖原合成途徑中的限速酶,對(duì)肝糖原代謝起著至關(guān)重要的作用,其基因突變能導(dǎo)致青幼年發(fā)病的成年型糖尿病(maturityonsetdiabetesoftheyoung,MODY)的發(fā)生'".基于Cre?616?loxP條件性基因打靶技術(shù),本室構(gòu)建了肝臟特異性敲除模型鼠肝

14、組織中葡萄糖激酶的蛋白表達(dá)顯著降低,由此我們推測(cè)葡萄糖激酶缺陷是導(dǎo)致該模型肝糖原含量減少的機(jī)制之一,進(jìn)而使血糖水平升高,引發(fā)糖尿病本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了4種糖尿病小鼠模型,并發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠模型均出現(xiàn)不同程度的肝糖原和肌糖原含量降低因此,我們認(rèn)為糖原代謝在糖尿病的發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用,糖原代謝異常是引發(fā)血中葡萄糖濃度升高的重要因素=此外,我們證實(shí)了葡萄糖激酶缺陷是引起葡萄糖激酶基因敲除模型肝糖原含量降低的分子機(jī)制之一=那么,其它糖尿病模型糖原含量降低的內(nèi)在分子機(jī)制又是什么呢?進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究將為糖尿病的防治和降血糖藥物的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù).參考文獻(xiàn)1ZhangYL.TanXH.XiaoMF.&

15、quot;H.MaoYQ.TanHR.iniee:anewanimalmodelforscreeningantidiabeticdrugsJ.ActaPharmacolSin,2004;25:1659652林志彬.抗糖尿病藥物實(shí)驗(yàn)法A.見:徐叔云.如濂.ChinJClinPharmaolTher2005Jun;10(6)陳修,主編.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)M.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:1516293ShulmanGI,RothmanDL.JueT.SteinP.DeFronzoRA.malsubjectsandsubjects,thnoninsulindependentdiabetesby

16、13CnuclearmagneticresonancespectroscopyJ.NEnglJMed,l990;322:2238mellituslJj.AmJPhysiolEndocrinolMetab,2004;287:El00275BisehofMG.BemroiderE.KrssakM,KrssakM.KrebsM,'afterlongternlnearnormogl(,lJJ.,;l:.semiaDiattes2002549546KrssakM,BrehmA,Berm'oiderE,AnderwaldC,Nowotonycogenmetabolismintype2r1i

17、abeteslJJ.Diabetes,2004;53:3O4856酶活性的改變J.北京醫(yī)科大學(xué),1998;30:468metabolismintheliverlJJ.BiochemJ,1998;336:193l9VelhoG,RobertJJ.Matm'ityonsetdiabetesoftheyoung(MODY):geneticandclinicalcharacteristicsJJ.HormRes,2002;57:2933onsetdiabetesoftheyoung(MODY).MODYgenesandnoninsulindependentdiabetesmeHituslJj.

18、DiabetesMeta1).1997;23:347ComparativestudyonchangesofglycogenmetabolisminmodelmiceofdiabetesmellitusXIAOMeifang,ZHANGXuemei,BAIXiang,TANHuanranDepartmentofPhatacolog),SchoolofBask'MedicalScience,PekingUniversi0,Beijing100083,China;DepartmentofPharmacolog),SchoolofBasicMedk'alScience,DalianUn

19、iversit)',Dalian116622,Liaoning,ChinaABSTRACTAIM:Toexplorethechangesofglycogenmetabolismindiabeticanimalmodelsandtheroleofglycogenmetabolisminthepathogenesisofdiabetesmellitus.METHODS:Firstlyfourtypesofdiabeticanimalmodelsweregeneratedincludingmicemodelsoftype1andtype2glycogencontentsofthesediabeticmiceweredeterminedaccordingtoanthronereagentmethodandglucokinaseexpressionsinliverofglucokinasegeneknockoutmicewereassayedusingwesternblo