生化試驗(yàn)轉(zhuǎn)氨酶GPT活性的測(cè)定報(bào)告

1、實(shí)驗(yàn)二（2）轉(zhuǎn)氨酶（GPT活性的測(cè)定一 研究背景及目的轉(zhuǎn)氨酶是生物體內(nèi)重要的一類酶。轉(zhuǎn)氨酶催化a -氨基酸的氨基與a -酮酸的 酮基之間的相互轉(zhuǎn)化而生成一種新的氨基酸與一種的新的酮酸， 這種作用被稱為 轉(zhuǎn)氨基作用 1 。轉(zhuǎn)氨酶種類很多，體內(nèi)除了賴氨酸、蘇氨酸外，其余a - 氨基酸都可參加轉(zhuǎn)氨基作用并各有其特異的轉(zhuǎn)氨酶。其中以谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT最為重要。GPT與 GOT舌性的測(cè)定在臨床上有著重要應(yīng)用，可作 為一些疾病診斷的指標(biāo)。GPT催化的是谷氨酸與丙酮酸之間的轉(zhuǎn)氨作用，GOT崔化的是谷氨酸與草酰乙酸之間的轉(zhuǎn)氨作用， 草酰乙酸在檸檬酸苯胺溶液中可以轉(zhuǎn) 變?yōu)楸崤c二氧化碳。

2、由于都有丙酮酸的生成， 所以可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定一定時(shí) 間內(nèi)丙酮酸的生成量而計(jì)算這兩種轉(zhuǎn)氨酶的活性。 本實(shí)驗(yàn)以動(dòng)物的新鮮肝臟和血 清為材料，分別測(cè)定其中的GTP的活性，以此來(lái)研究該轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定方法。二 原理由于動(dòng)物肝臟和血清中的轉(zhuǎn)氨酶活性較高， 易于測(cè)得， 且動(dòng)物或人的轉(zhuǎn)氨酶 活性的測(cè)定應(yīng)用廣泛、 技術(shù)成熟，因此本試驗(yàn)選取家兔的新鮮肝臟和血清為實(shí)驗(yàn) 材料，對(duì)其中的一種重要轉(zhuǎn)氨酶一一 GTP的活性進(jìn)行測(cè)定。轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定的歷 史沿革建立了金氏法、 穆氏法及賴氏法等較成熟的基本方法， 本實(shí)驗(yàn)采用的是金 氏法。該方法對(duì)轉(zhuǎn)氨酶活力的定義是：血清在 37C, pH7.4條件下，與底物作用 60min后，

3、每生成1卩M丙酮酸為一個(gè)轉(zhuǎn)氨酶活性單位。丙酮酸含量的測(cè)定運(yùn)用 的是比色法。丙酮酸可與 2,4- 二硝基苯肼反應(yīng)，生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿 性溶液中顯棕紅色，所以通過(guò)測(cè)定溶液在520nm下的光吸收值并與標(biāo)準(zhǔn)溶液比色 便可計(jì)算出丙酮酸的含量，丙酮酸的含量對(duì)應(yīng)于一定的轉(zhuǎn)氨酶活力單位。三 材料、試劑與儀器材料：新鮮家兔肝臟和血清試劑1 ： 磷酸鹽緩沖液（ pH7.4） 甲液： 1/15 mol/L 磷酸氫二鈉溶液 乙液： 1/15 mol/L 磷酸氫二鉀溶液 取甲液825ml，乙液175ml,混合，測(cè)得pH為7.4即可。 GTP 基質(zhì)液稱取a -酮戊二酸29.2mg及DL-丙氨酸1.78g，溶于pH

4、7.4的磷酸鹽緩沖液20ml 中，再加緩沖液70ml,并移入100ml容量瓶中，加1mol/L的氫氧化鈉溶液0.5ml , 校正pH至7.4，再以pH7.4的磷酸鹽緩沖液定容。貯存于冰箱中備用，可保存 一周時(shí)間。 2,4- 硝基苯肼溶液稱取2,4二硝基苯肼20mg先溶于10ml濃鹽酸中，再以蒸餾水稀釋至100ml， 棕色試劑瓶?jī)?nèi)保存。 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液精確稱取丙酮酸鈉22mg溶解后轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，用pH7.4的磷酸鹽緩沖 液定容即可。 檸檬酸苯胺溶液取檸檬酸 50g 溶于 50ml 蒸餾水中，再加苯胺充分混合即可，低溫出現(xiàn)結(jié)晶時(shí)， 可置于37C水浴中溶解后應(yīng)用。 0.4M 氫氧化鈉溶液儀器

5、：DK-S2 4型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，編號(hào)L304056）TPL-4OB氐溫臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，編號(hào)20070529）722光柵分光光度計(jì)（上海緊密科學(xué)儀器有限公司）大龍系列加樣器及吸頭（20-200卩l(xiāng)，100-1000卩l(xiāng)，1000-5000卩）JP-100架盤藥物天平（美國(guó)雙杰兄弟有限公司，編號(hào)3878）配平天平（北京醫(yī)用天平廠） 刻度試管，離心管，小燒杯，勻漿器，洗瓶，冰浴四 操作步驟1 取 健康家兔，處死。心臟采血，分裝至離心管（生理鹽水浸潤(rùn)）， 4000 轉(zhuǎn)氐溫離心15min,取上清液冰浴待用。取肝臟，生理鹽水沖洗瀝干，取1g勻漿， 用磷酸鹽緩沖液

6、定容至10ml，4000轉(zhuǎn)低溫離心15min,取上清液，冰浴，記 為肝臟研磨液1。取2ml肝臟研磨液1,用磷酸鹽緩沖液定容至4ml，冰浴， 記為肝臟研磨液 2。2取 6 支試管，編號(hào)，按下表操作 1管號(hào)123456丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液00.050.100.150.200.25GPT底 物0.500.450. 400.350.300.25磷酸鹽緩沖液0.10.10.10.10.10.1再取18支試管，分為三組，每組6支，分別用于測(cè)定血清、肝臟研磨液 1、 肝臟研磨液2的GPT舌性，6支試管中3支作為測(cè)定管，另外3支作為對(duì)照管。 按下表操作：試劑（單位ml）測(cè)定管對(duì)照管血清或肝臟勻漿液0.10.137 T

7、 水浴 5minGPT底 物0.5將完成以上操作的24支試管按下表操作:37 C 水浴 30min各管加入2,4-二硝基苯肼0.5ml9支對(duì)照管中各加入GPT底物0.5ml37 T 水浴 20min各管加入 0.4M NaOH5.0ml10min后從水浴中取出各試管，待冷卻至室溫，520nm下比色，記錄消光值五.數(shù)據(jù)整理1 .標(biāo)準(zhǔn)曲線相當(dāng)于谷丙轉(zhuǎn)氨酶單位0285797150200OD52000.0980. 1750. 2510.3000.358標(biāo)準(zhǔn)曲線0.5000.4000.3000.2000.1000.0002. GPT活性測(cè)定2.1血清中GPT舌性的測(cè)定項(xiàng)目測(cè)定1測(cè)定2測(cè)定3對(duì)照1對(duì)照2對(duì)

8、照3ODbo0. 1140.1090.1290.0080.0120.003均值0.1170.008均值差0.109酶活單位36.82.2肝臟研磨液1中GPT舌性的測(cè)定項(xiàng)目測(cè)定1測(cè)定2測(cè)定3對(duì)照1對(duì)照2對(duì)照30険00.5100.5080.5080.0620.0630.066均值0.5090.064均值差0.445酶活單位234.52.3肝臟研磨液2中GPT活性的測(cè)定項(xiàng)目測(cè)定1測(cè)定2測(cè)定3對(duì)照1對(duì)照2對(duì)照3ODbo0.4500.4450.4490.0330.0360.043均值0.4480.037均值差0.411酶活單位214.5六.結(jié)果計(jì)算與分析根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0017x+0.0464

9、（ y對(duì)應(yīng)于0D值，x對(duì)應(yīng)于酶活單位）計(jì)算各三種樣品光吸收值（以測(cè)定管均值與對(duì)照管均值之差計(jì)算）對(duì)應(yīng)的酶活單位，結(jié)果匯總?cè)缦?樣品血清肝臟研磨液1肝臟研磨液2GPT舌性單位36.8234.5214.5以上結(jié)果顯示：血清中GPT活性較高，而肝臟中的GPT舌性特別的高，盡管 稀釋了一定的倍數(shù)，仍然超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定的范圍。 我們知道，研磨液2是由 研磨液1稀釋2倍得到的，但是其活性完全與稀釋倍數(shù)不成比例。 我認(rèn)為這是由 兩個(gè)方面的原因造成的：肝臟中GPT活性過(guò)高，催化反應(yīng)中GPT過(guò)量，其活性 沒有得到完全的體現(xiàn)，所以稀釋后活性沒有按稀釋倍數(shù)降低；肝臟研磨液稀釋 倍數(shù)不夠，使得產(chǎn)物濃度超出了比色法的

10、線性范圍， 最終導(dǎo)致通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 計(jì)算得到的酶活單位存在較大誤差。七.結(jié)論與展望通過(guò)以上的計(jì)算與分析， 本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論是： 通過(guò)比色法測(cè)定一定時(shí)間內(nèi) 轉(zhuǎn)氨酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物的含量來(lái)表征轉(zhuǎn)氨酶的活性的方法是可行的， 關(guān)鍵的問(wèn)題 在于如何確定底物及酶的濃度從而使得酶的活性得到最大程度的發(fā)揮且底物濃 度適于比色法的測(cè)定。 本實(shí)驗(yàn)中由于肝臟中轉(zhuǎn)氨酶活性過(guò)高， 稀釋倍數(shù)不夠， 導(dǎo) 致產(chǎn)物濃度過(guò)大， 超出了比色法的最適測(cè)定范圍， 得到的數(shù)據(jù)誤差較大。 所以希 望以后的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛘{(diào)整肝臟研磨液的稀釋倍數(shù)，更加準(zhǔn)確地測(cè)定轉(zhuǎn)氨酶的活性。 八 實(shí)驗(yàn)小結(jié)本次實(shí)驗(yàn)比較成功， 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒有出現(xiàn)明顯失誤。 由于實(shí)驗(yàn)室

11、配備了加樣 器取代了原來(lái)的移液管， 使得加樣速度大大提高， 最終我們小組在較短時(shí)間內(nèi)順 利完成了實(shí)驗(yàn)。 此外從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中也發(fā)現(xiàn)： 各平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相差較小， 可見平行 性良好，實(shí)驗(yàn)操作帶來(lái)的偶然誤差較小。九 參考文獻(xiàn)1 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 19-22 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)自編教材附：兩種酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)的主要設(shè)計(jì)細(xì)節(jié)異同點(diǎn)分析比較：淀粉酶與轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定在實(shí)驗(yàn)的整體思路上是相同的， 但是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上 存在著許多不同之處，各自具有其特點(diǎn)，具體表現(xiàn)為以下幾點(diǎn)：首先，制備酶液的方法不同： 淀粉酶活性測(cè)定中采用的是萌發(fā)的小麥種子的 研磨稀釋液， 轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定中采用的是家兔的血清及肝臟

12、研磨稀釋液。 作如 此選擇是出于實(shí)驗(yàn)的可操作性及現(xiàn)實(shí)意義的考慮。 萌發(fā)的種子中的淀粉酶活性和 動(dòng)物血清及肝臟中的轉(zhuǎn)氨酶活性都比較高， 所以選取它們易于較準(zhǔn)確地測(cè)得酶活 性；此外，萌發(fā)的種子中淀粉酶活性的測(cè)定對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義， 而動(dòng)物或人的血清及肝臟中轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定在臨床上具有重要應(yīng)用， 所以以它 們?yōu)閷?shí)驗(yàn)材料的研究在技術(shù)上比較成熟而且具有現(xiàn)實(shí)意義。第二，淀粉酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)是以兩種淀粉酶一一a淀粉酶和B淀粉酶為研究 對(duì)象的，而轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)是以一種轉(zhuǎn)氨酶 GPT為研究對(duì)象的。也就是說(shuō)， 淀粉酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)以一種生物材料來(lái)研究?jī)煞N淀粉酶的活性而轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè) 定實(shí)驗(yàn)以兩種生物材料

13、來(lái)研究一種轉(zhuǎn)氨酶的活性。具體的實(shí)現(xiàn)測(cè)定的策略分別 是：淀粉酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定a淀粉酶 （抑制了 B淀粉酶活性）活性及兩種 淀粉酶的總活性；轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了血清中的 GPT活性及兩種不同 稀釋倍數(shù)的肝臟研磨液的 GPT活性。如此設(shè)計(jì)主要出于兩方面的考慮：實(shí)驗(yàn)的可 操作性及典型性。因?yàn)閷?duì)于淀粉酶的測(cè)定，通過(guò)抑制B淀粉酶活性來(lái)測(cè)定a淀粉 酶活性是易于實(shí)現(xiàn)的；而對(duì)于轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定，GPT是 一種體內(nèi)最重要的轉(zhuǎn)氨酶之一，所以其活性測(cè)定具有典型性，通過(guò)測(cè)定GPT在不同組織中的活性能夠?qū)?現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶活性研究的目的。第三，酶活性的測(cè)定是通過(guò)酶促反應(yīng)的產(chǎn)物測(cè)定實(shí)現(xiàn)的， 淀粉酶活性測(cè)定實(shí) 驗(yàn)中測(cè)定

14、的產(chǎn)物是麥芽糖，這是因?yàn)閮煞N淀粉酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物幾乎都是麥芽 糖，所以麥芽糖的產(chǎn)量能夠表征淀粉酶的活性， 而且麥芽糖的含量易于通過(guò)比色 法測(cè)得；同樣道理，轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的是催化產(chǎn)物中的丙酮酸的含量。第四，酶活力單位的定義不同： 淀粉酶活力單位的定義是： 每分鐘每克鮮重 麥種所催化生成的麥芽糖毫克數(shù)； 轉(zhuǎn)氨酶活力單位的定義是： 血清（或肝臟研磨 液）在37C, PH7.4條件下，與底物作用60min生成1卩M丙酮酸為一個(gè)轉(zhuǎn)氨酶活力單位。 第五，酶促反應(yīng)的條件不同，主要表現(xiàn)在溫度的不同：淀粉酶的反應(yīng)是在40 °C下進(jìn)行的，而轉(zhuǎn)氨酶的反應(yīng)在 37 °C。這是由于這兩種酶

15、的最適溫度不同， 淀粉酶的最適溫度是40C而轉(zhuǎn)氨酶的最適溫度是37C，由于酶活性的測(cè)定要求 在“最適條件下”測(cè)定，所以設(shè)定這樣的反應(yīng)溫度。第六，酶促反應(yīng)的時(shí)間不同：淀粉酶活性測(cè)定的反應(yīng)時(shí)間為準(zhǔn)確的 5 分鐘， 而轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定的反應(yīng)時(shí)間是 30mi n。這是由這兩種酶促反應(yīng)的特點(diǎn)決定的： 淀粉酶催化的反應(yīng)快速靈敏， 在較短時(shí)間內(nèi)完成； 而轉(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)屬于可逆 反應(yīng)，反應(yīng)速率較慢，需要較長(zhǎng)的時(shí)間反應(yīng)才能夠建立平衡。第七，酶活力測(cè)定的要求之一是保證測(cè)定的是反應(yīng)的初速度， 那么這兩個(gè)實(shí) 驗(yàn)分別是如何實(shí)現(xiàn)的呢？淀粉酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)中通過(guò)制備低濃度酶液以及控制 短時(shí)間的反應(yīng)來(lái)保證反應(yīng)的初速度； 轉(zhuǎn)氨酶

16、活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)中則通過(guò)底物濃度的設(shè) 定來(lái)保證反應(yīng)的初速度。 這是基于這兩種酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性來(lái)設(shè)計(jì)的： 淀粉酶 的催化反應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)完成， 酶活性很高， 所以要求以低濃度的酶液在短時(shí)間內(nèi) 反應(yīng)；轉(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)屬于雙底物可逆反應(yīng)， 反應(yīng)速率較低， 所以通過(guò)設(shè)定過(guò) 量的底物以及合理配制兩種底物的比例即可保證反應(yīng)的初速度。第八，實(shí)驗(yàn)整體的復(fù)雜度不同： 綜合來(lái)看， 轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜度較 淀粉酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)的高。這是因?yàn)椋恨D(zhuǎn)氨酶催化反應(yīng)的機(jī)理較淀粉酶的復(fù)雜。 前者為雙底物可逆酶促反應(yīng)， 后者為單一底物的不可逆酶促反應(yīng)。 可見轉(zhuǎn)氨酶活 性測(cè)定的實(shí)驗(yàn)的干擾因素比較復(fù)雜， 其底物濃度及兩種底物濃度比等

17、也成了實(shí)驗(yàn) 的影響因素。此外轉(zhuǎn)氨酶催化反應(yīng)的可逆性決定了只能測(cè)定原始的產(chǎn)物濃度而不 能像淀粉酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)菢訉a(chǎn)物經(jīng)過(guò)稀釋等處理后再進(jìn)行測(cè)定， 這就使得測(cè) 定的酶液濃度受到嚴(yán)格的限制，因?yàn)楸壬y(cè)定底物濃度的范圍是受到限制的。 實(shí)驗(yàn)材料不同。 轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)采用的是動(dòng)物的血清和肝臟而淀粉酶活性 測(cè)定實(shí)驗(yàn)采用的是植物萌發(fā)的種子。顯然動(dòng)物材料較難獲取且酶液的制備較麻 煩，更重要的是， 動(dòng)物不同個(gè)體的器官或組織甚至同一器官或組織的不同部位的 轉(zhuǎn)氨酶活性存在較大差異， 因此制備酶液時(shí)的稀釋倍數(shù)較難確定， 一般需要通過(guò) 先行實(shí)驗(yàn)才能確定； 而相同條件下萌發(fā)的種子的淀粉酶活性比較一致， 酶液的配 制可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行。最后，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)整體的嚴(yán)謹(jǐn)性不同： 淀粉酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)較轉(zhuǎn)氨酶活 性測(cè)定實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)。 這是由實(shí)驗(yàn)整體的復(fù)雜度決定的， 既然淀粉酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn) 復(fù)雜度較低，那么就容易做到設(shè)計(jì)上的嚴(yán)謹(jǐn)。首先，由于反應(yīng)速率較快，所以設(shè) 定準(zhǔn)確反應(yīng)時(shí)間5mi n，并通過(guò)強(qiáng)堿溶液立刻停止酶促反應(yīng)。另外，在測(cè)定產(chǎn)物 濃度時(shí)，先使產(chǎn)物在高溫下發(fā)生顏色反應(yīng)， 然后稀釋至