狂犬病病毒中和抗體檢測快速熒光灶抑制試驗(yàn)的建立

1、 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志2010年2月第20卷第2期Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Feb 2010; Vol 20No 2439【經(jīng)驗(yàn)交流】狂犬病病毒中和抗體檢測快速熒光灶抑制試驗(yàn)的建立呂新軍, 唐青, Herv éBourhy , 馬學(xué)軍11213(11中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所, 北京100052; 21Pasteur I nstitute Paris, 75724關(guān)鍵詞狂犬病病毒; 中和抗體; 快速熒光灶抑制試驗(yàn)中圖分類號R183. 9文獻(xiàn)標(biāo)識碼C 文章編號1004-8685(2010 02-0439-

2、03RFF I T 是WHO 推薦的檢測狂犬病病毒中和抗體的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法1, 美國疾病預(yù)防控制中心狂犬病實(shí)驗(yàn)室、法國巴斯德研究所狂犬病實(shí)驗(yàn)室等國際知名狂犬病研究機(jī)構(gòu)都采用該方法進(jìn)行狂犬病病毒中和抗體檢測, 保護(hù)水平的中和抗體效價(jià)應(yīng)015I U /ml 。RFF I T 主要應(yīng)用于狂犬病疫苗的免疫學(xué)效2, 3果評估和狂犬病病毒中和抗體替代檢測試劑和方法的評4, 5估, 是狂犬病疫苗及中和抗體診斷試劑評價(jià)的關(guān)鍵技術(shù)。近5年來我國每年因狂犬病死亡25003500人6, 僅次于印度位居全球第二。面對國內(nèi)嚴(yán)峻的狂犬病疫情, 國家衛(wèi)生職能部門強(qiáng)化了狂犬病的免疫預(yù)防措施, 一些大型狂犬病免疫干預(yù)項(xiàng)目逐步具備

3、實(shí)施條件, 國內(nèi)狂犬病病毒中和抗體檢測需求快速增長, 在我國疾病預(yù)防控制體系內(nèi)建立RFF I T 十分必要。RFF I T , 推廣應(yīng)用的主要障礙先建立了RFF I T 檢測體系, 為狂犬病疫苗大量應(yīng)用的免疫學(xué)檢測和監(jiān)測提供了可靠的技術(shù)支持。1材料與方法111病毒、細(xì)胞系和標(biāo)準(zhǔn)血清113待測樣品編號為CL 、HY 、JY 、DJL 、WXG 、T L 的6份待測血清來自本實(shí)驗(yàn)室健康研究人員, 均具有完整和清晰的背景資料, 其中編號為T L 的研究人員從未接受過狂犬病疫苗免疫, 其血清作為陰性對照血清, 另外5人接受過狂犬病疫苗暴露前免疫, 其血清作為待測陽性血清。114細(xì)胞懸液的制備25c m

4、 方瓶培養(yǎng)的BSR 細(xì)胞鋪滿單層后倒掉培養(yǎng)液, 0125%胰酶液和0102%Versene 液1:3混合作為消化液, 以2m l 消化液洗滌細(xì)胞2次, 加入2m l 消化液消化, 當(dāng)細(xì)胞開始2, 5m l DM E M 培養(yǎng)液, , 1, 根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果補(bǔ)加6E 養(yǎng)到1×10細(xì)胞/ml 。每個(gè)25c m 1m l 上述細(xì)胞懸液, 用10%F BS 的DM E M 7m l 于375%C O 2孵箱孵育7296h 。115病毒種子的制備25c m 方瓶需上述細(xì)胞懸液1m l, 其它規(guī)格的方瓶所需細(xì)胞懸液體積以此類推。按照感染指數(shù)(MO I 為011計(jì)算所需2已知病毒滴度的C VS -11

5、上清的體積, 將CVS -11上清加入方瓶內(nèi)混合均勻, 375%C O 2孵箱孵育1h, 期間每510m in 搖勻1次, 補(bǔ)足10%F BS 的DME M 培養(yǎng)液, 375%C O 2孵箱孵育72h, 收獲病毒上清, 測定病毒滴度, 大于10FF U /ml 可以使用。連續(xù)感染3代細(xì)胞, 每代收獲的病毒6已知病毒滴度的狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS -11上清和BSR 細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存, 30I U /ml 標(biāo)準(zhǔn)血清凍干品由英國國立生物制品和控制標(biāo)準(zhǔn)品研究所提供。112試劑和儀器DME M 培養(yǎng)液購自Gibico 公司, 胎牛血清(Fetal Seru m of Bovine, F BS

6、購自四季清生物制品有限公司, 100U /ml 青霉素和鏈霉素雙抗混和液、0125%胰酶液、0102%Versene液由本所配液室提供, 抗狂犬病病毒核蛋白熒光抗體購自M illi pore 公司。普通倒置光學(xué)顯微鏡為OLY M P US CX41型, 正置熒光顯微鏡為OLY MP US I X51型?；痦?xiàng)目十一五科技重大專項(xiàng)-傳染病檢測技術(shù)研究-傳染病病原體診斷和組合檢測技術(shù)(2008ZX10004-002 ; 中美新發(fā)和再發(fā)傳染病合作項(xiàng)目(2007-2008I D :9141211-2 ; 法國賽諾菲-巴斯德公司中國大陸學(xué)者赴法培訓(xùn)資助項(xiàng)目(2008年度作者簡介呂新軍(1973- , 男

7、, 醫(yī)學(xué)博士, 副研究員, 主要從事病毒病預(yù)防控制工作。3通訊聯(lián)系人, E -mail:maxj2004yahoo1com 1cn上清按照015m l/管分裝, -70冰箱保存, 分別作為第1、2、3代病毒種子。116病毒種子80%感染量的測定在96孔檢測板上選擇1行每孔加10%F BS 的DME M 培養(yǎng)液50l; 在另1塊96孔稀釋板上選擇1行每孔加70l 10%F BS 的DM E M 培養(yǎng)液, 取70l 第3代病毒種子上清加入第1孔, 進(jìn)行1:2倍比稀釋, 每個(gè)稀釋度取50l 加入96孔檢測板上各孔中; 每孔加入1×106細(xì)胞/ml 的細(xì)胞懸液50l, 混勻, 375%C O

8、 2孵箱培養(yǎng)24h 。常規(guī)進(jìn)行F AT 檢測, 確定80%細(xì)胞被感染的病毒稀釋倍數(shù)。117待測樣品的檢測在1塊96孔檢測板上縱向選擇7行每孔加10%F BS 的DM E M 培養(yǎng)液100l, 第1行設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)血清稀釋系列, 第2行設(shè)為陰性對照血清稀釋系列, 每份血清取50l 加入單行第1孔內(nèi), 進(jìn)行1:3倍比稀釋, 最后1孔棄去50l; 取出第3代病毒種子, 融化, 按照80%感染量進(jìn)行稀釋, 前述每孔加50l 病毒稀釋液, 375%CO 2孵箱孵育1h 進(jìn)行中和作用; 每孔6加入1×10細(xì)胞/ml 的細(xì)胞懸液50l, 混勻, 375%C O 2 440中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志2010年2月第

9、20卷第2期Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Feb 2010; Vol 20No 2孵箱培養(yǎng)24h 。常規(guī)進(jìn)行F AT 檢測, 計(jì)算待測樣品狂犬病病毒中和抗體滴度。118中和效價(jià)計(jì)算以Reed &M uench 法公式和M icr os oft Excel 表函數(shù)功能為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)被測樣品中和效價(jià)計(jì)算方法, 固定標(biāo)準(zhǔn)血清50%細(xì)胞感染量前/后1孔內(nèi)細(xì)胞感染比例, 輸入待測血清50%細(xì)胞感染量前/后1孔內(nèi)細(xì)胞感染比例即可自動得出待測血清中狂犬病病毒中和抗體效價(jià)值(表1 。表1中和效價(jià)Excel 表聯(lián)鎖計(jì)算公式待測血清X =

10、高于50%分界點(diǎn)的細(xì)胞感染量x =低于50%分界點(diǎn)的細(xì)胞感染量r =稀釋比例214檢測體系穩(wěn)定性和有效性的初步分析5份樣品3次重復(fù)檢測變異系數(shù)011, 說明檢測體系穩(wěn)標(biāo)準(zhǔn)血清70, 00X =高于50%分界點(diǎn)的細(xì)胞感染量30, 00x =低于50%分界點(diǎn)的細(xì)胞感染量3, 00r =稀釋比例60, 0040, 003, 00定性良好, 可用于其他樣品檢測。從樣品背景信息可知, 5人均采用賽諾菲-巴斯德公司同一生產(chǎn)批號的韋爾伯人用狂犬病疫苗實(shí)施0、7、28d 暴露前免疫注射, 首劑注射后45d 采血檢測狂犬病病毒中和抗體。編號WXG 的個(gè)體在規(guī)定的3針注射外于14、21d 加強(qiáng)注射了2針, 結(jié)果顯

11、示其中和抗體效價(jià)較高。編號為JY 的個(gè)體在接受狂犬病疫苗免疫后也存在中和抗體效價(jià)較低的情況, 顯示與其自身免疫狀態(tài)有關(guān)。編號C L 、HY 、DJL 的個(gè)體產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)適中, 達(dá)到了預(yù)期的保護(hù)作用。檢測結(jié)果較好地反映了個(gè)體的真實(shí)免疫反應(yīng)狀況, 說明了檢測體系的有效性。3討論F =低于50%分界點(diǎn)的血清稀釋倍數(shù)81, 00F =低于50%分界點(diǎn)的血清稀釋倍數(shù)729, 002, 1550%分界點(diǎn)對應(yīng)血清稀釋倍數(shù)140, 3050%分界點(diǎn)對應(yīng)血清稀釋倍數(shù)3, 101262, 670, 15變異系數(shù)中和效價(jià)2, 292結(jié)果211病毒種子的滴度本室保存的CVS -111110FF U l, 按照M

12、O I =011連續(xù)3, 、27分別為814×10FF U l ×/ml FF U l, U 以上。212第3代病毒種子80%感染量第3代病毒種子在25稀釋度(32倍稀釋 時(shí)80%細(xì)胞被5感染, 對應(yīng)病毒滴度為6125×10FF U /ml 。因此, 在本室RF 2F I T 檢測中第3代病毒種子稀釋32倍后作為攻擊病毒用于中和作用。213待測樣品中和抗體效價(jià)F AT 檢測結(jié)果顯示檢測板上標(biāo)準(zhǔn)血清稀釋系列第6孔內(nèi)細(xì)胞感染比例為40%, 第7孔內(nèi)細(xì)胞感染比例為60%, 將上述結(jié)果輸入中和效價(jià)計(jì)算公式內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)血清對應(yīng)欄內(nèi)。陰性對照血清稀釋系列各孔內(nèi)細(xì)胞感染比例差別很小,

13、 均在50%以上。將其余待測血清稀釋系列50%細(xì)胞感染量前/后孔內(nèi)細(xì)胞感染比例輸入中和效價(jià)計(jì)算公式內(nèi)得出相應(yīng)中和抗體效價(jià)(表2 。表25份暴露前免疫人員血清中和抗體效價(jià)測定結(jié)果CL第1次檢測第2次檢測第3次檢測平均值標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)狂犬病患者病死率幾乎100%, 迄今尚無有效治療方法和藥物, 進(jìn)行狂犬病暴露前和暴露后免疫是防制人間狂犬病的重要措施, 人體接種狂犬病疫苗后狂犬病毒中和抗體效價(jià)1015I U /ml 即可認(rèn)為達(dá)到有效保護(hù)水平。國內(nèi)每年使用狂犬病疫苗12001500萬人份, 我國疾病預(yù)防控制體系迫切需要開展狂犬病疫苗應(yīng)用后的免疫學(xué)檢測和監(jiān)測。目前世界衛(wèi)生組織向全球推薦的狂犬病病毒中和抗

14、體檢測試驗(yàn)包括RFF I T 和, 在17I T RFF I T 檢測體系經(jīng)過初步驗(yàn)證能夠真實(shí), 可應(yīng)用于狂犬病病毒中和抗體檢測, 擬擴(kuò)大檢測樣品數(shù)量, 完善體系靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性等主要指標(biāo)的評價(jià)。由于完成一次RFF I T 最少需要2d 時(shí)間, 而且操作技術(shù)要求較高7, 因此研究者推出一些替代性的E L I S A 檢測試劑或是改良試驗(yàn)方法來檢測狂犬病病毒中和抗體效價(jià)。RFF I T 是評價(jià)這些試劑和改良試驗(yàn)方法的金標(biāo)準(zhǔn), 已有的研究顯示在商業(yè)化的狂犬病病毒中和抗體替代檢測試劑中靈敏度和特異性與RFF I T 接近的非常少見5。國內(nèi)個(gè)別地方疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)在狂犬病疫苗免疫后的血清

15、中和抗體檢測中也有采用8E L I S A 法的, 但是很少通過RFF I T 進(jìn)行過評價(jià)。我們在國內(nèi)疾病預(yù)防控制體系內(nèi)建立和推廣RFF I T 將在很大程度上改變這種狀況, 減少狂犬病疫苗免疫項(xiàng)目實(shí)施效果監(jiān)測中的盲目性。本室在RFF I T 建立中結(jié)合國內(nèi)疾病預(yù)防控制體系的實(shí)際工作條件對美國疾病預(yù)防控制中心和法國巴斯德研究所的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行了改進(jìn), 從而使得操作更加容易進(jìn)行, 便于向地方疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)推廣, 初步應(yīng)用結(jié)果顯示這些改進(jìn)并不影響新的RFF I T 檢測體系的效能。實(shí)際上針對RFF I T 的改進(jìn)一直在進(jìn)行, 法國P éhar p r éD 等在RFF I T

16、結(jié)果的自動化判讀方面獲得成功9, 日本Kha wp l od P 等應(yīng)用表達(dá)綠色熒光蛋白的r HEP -GFP 重組狂犬病毒作為攻擊病毒進(jìn)行RFF I T, 無需進(jìn)行F AT 即可直接觀察結(jié)果10。本室RFF I T 結(jié)果觀察采用與熒光顯微鏡配套的電腦成像系統(tǒng)進(jìn)行, 避免了直接進(jìn)行熒光觀測導(dǎo)致的視力損傷, 也顯示技術(shù)進(jìn)步為RFF I T 操作提供了更大的便利性。(下轉(zhuǎn)第458頁 458中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志2010年2月第20卷第2期Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Feb 2010; Vol 20No 2Ep idem i ol,

17、 2002, 12(6 :433-440117W hyatt RM , BarrDB 1Measure ment of organophos phate metabolites inpost partum meconium as a potential bi omarker of p renatal exposure:a validati on study J 1Envir on Health Pers pect, 2001, 109:417-420118Ostrea E M Jr, Biela wskiD M, Poseci on NC Jr, et al 1A co mparis on o

18、f in 2fant hair, cord bl ood and meconiu m analysis t o detect fetal ex posure t o envir on mental pesticidesJ1Envir on Res, 2008, 106(2 :277-83119Enrique M O strea J r, Da wn M B ielawski, Norbert o C Poseci on J r, etal 1Combined analysis of p renatal (maternal hair and bl ood and neo 2natal (infa

19、nt hair, cord bl ood and meconium matrices t o detect fetal exposure t o envir onmental pesticides J 1Envir on Research, 2009, 109(1 :116-122120A sa B radman, Dana B Barr, B irgit G Claus Henn, et al . Measure 2ment of pesticides and other t oxicants in a mni otic fluid as a potential bi omarker of

20、p renatal exposure:a validati on study J 1Envir on Health Pers pect, 2003, 111(14 :1779-1782121W essels Denise, Dana B Barr, Pauline Mendola 1U se of bi omarkers t oindicate exposure of children t o organophos phate pesticides:i m p lica 2ti ons f or a l ongitudinal study of children s envir onmenta

21、l health J .Envir on Health Pers pect, 2003, 111:1939-19461(收稿日期:2009-11-04的可行性研究J 1中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志, 2002, 15(4 :205-207110劉國紅, 劉西平, 楊克敵1產(chǎn)婦體內(nèi)有機(jī)氯農(nóng)藥殘留對血中4種生殖激素水平的影響J 1環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué), 2005, 12(6 :519-522111Luzardo OP, Mahtani V, Tr oyano J M , et al 1Deter m inants of organo 2chl orine levels detectable in the a mni

22、 otic fluid of women fr om Tenerife Island (Canary Islands, Spain J 1Envir on Res, 2009, 109(5 :607-613112姚新民, 周志俊1長期接觸低劑量有機(jī)磷農(nóng)藥對人體健康影響的研究進(jìn)展J 1環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué), 2008, 25(4 :409-411113Jaga K, Dhar mani C 1Sources of exposure t o and public health i m p li 2cati ons of organophos phate pesticidesJ 1Pan Am J Pub

23、lic Health, 2003, 14(3 :171-185114Denise W , Dana B Barr, Pauline Mendola 1U se of bi omarkers t o indi 2cate exposure of children t o organophos phate pesticides:i m p licati ons for a l ongitudinal study of children s envir onmental health J .Envi 2r onment Health Pers pect, 2003, 111:1939-1946115

24、孫運(yùn)光, 周志俊, 顧祖維1有機(jī)磷農(nóng)藥生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展J 1勞動醫(yī)學(xué), 2000, 17(1 :58-60116RoysterMO, H ilborn ED, Barr D , et al 1A p il ot study of gl obal posi 2ti oning syste m /geographicalinfor mati on syste m measurement of resi 2dential p r oxi m ity t o agricultural fields and urinary organophos phate metabolite concentrat

25、i ons in t oddlersJ 1Exposure Analysis Envir on(上接第440頁參考文獻(xiàn)1World Health O rganizati on 1WHO expert consultati on on rabies, 2004,First Report; WHO technical report series #9311World Health O rgani 2zati onM1Geneva, S witzerland, 200512Shanbag P, Shah N, Kulkarni M , et al 1Pr dren against rabies:p

26、re -on chick 2bryo cell vaccine ( or ver (P VRV J 1Hum 4 :-36913Manicka ma R, R, et al 1Post exposure p r oph 2ylaxis (PEP of rabies -infected I ndian street dogs J 1Vaccine, 2008, 26(51 :6564-656814Shi ota S, Mannen K, Matsumot o T, et al 1Devel opment and evaluati onof a rap id neutralizing antibo

27、dy test f or rabies J 1J V ir ol Methods, 2009, Epub ahead of p rint15W elch RJ, Anders on BL, L it w in C M 1An evaluati on of t w o commercial 2ly available EL I S A s and one in -house reference laborat ory EL I S A forthe deter m inati on of human anti -rabies virus antibodiesJ 1J Med M icr obi

28、ol, 2009, 58(Pt 6 :806-16宋淼, , 馮子健, 等-年中國狂犬病流行特征分J 1, (6 :584-58717asnie , F 1ools f or rabies ser ol ogy t o moni 2t vaccinati on in domestic and wild carni 2J 1B i ol (Basel , 2006, 125:91-9418李懷昕, 汪武新, 謝遠(yuǎn)輝1830例狂犬疫苗接種后抗體檢測結(jié)果分析J 1中國熱帶醫(yī)學(xué), 2006, 6(12 :2153-215419P éhar pr éD, Cliquet F, Sagn éE, et al 1Co