植物超氧化物歧化酶的制備工藝研究

1、植物超氧化物歧化酶的制備工藝研究         作者：江紅霞，季本華，朱素琴 【摘要】 目的優(yōu)化植物超氧化物歧化酶（SOD）的制備工藝。方法用熱變性沉淀、等電點沉淀，45%，90%硫酸銨分級沉淀、DEAE-纖維素離子交換層析，冷凍濃縮干燥等方法，從黃瓜中制備SOD，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。用考馬斯亮藍G-250法測                

2、60;                  作者：江紅霞，季本華，朱素琴【摘要】  目的優(yōu)化植物超氧化物歧化酶（SOD）的制備工藝。方法用熱變性沉淀、等電點沉淀，45%，90%硫酸銨分級沉淀、DEAE-纖維素離子交換層析，冷凍濃縮干燥等方法，從黃瓜中制備SOD，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量，用NBT光還原法測定SOD活性。結果SOD酶比活為89.2381 U·mg-1，回

3、收率為18.41%，提純倍數(shù)為11.02倍。結論該工藝簡便高效地從植物中提純超氧化物歧化酶，可用于生產(chǎn)實際。 【關鍵詞】  超氧化物歧化酶； 制備工藝； SOD酶活力Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction technology of superoxide dismutase from plants. MethodsWe extracted SOD from the cucumber by heat treatment , isoelectric fraction, ammonium sulfate fractionation and

4、ion exchange chromatography, Coomassie brilliant blue G-250 was adopted to determine the content of the protein and NBT-reduction was used to measure the SOD activity. Meanwhile, the purified substance was identified as SOD by the polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and SOD activity staining.

5、ResultsSOD had a specific activity of 89.2381 U·mg-1. The yield rate was 18.41%, and the multiplication was as 11.02 times. ConclusionThe technology is an extraction technology of superoxide dismutase form plants simply and efficiently and it will be a good reference for the production.Key word

6、s：Superoxide dismutase(SOD)；  Extraction technology；  Activity of SOD    超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)，作為一種專一清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基(O2-·)的酶，催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應，減少超氧陰離子自由基對生物體的毒害。目前，人們已從動物、植物和微生物體內(nèi)分離得到，并且通過多種方法應用到實際中1，如應用到醫(yī)藥方面、食品、農(nóng)業(yè)、化妝品及人和動植物許多疾病的監(jiān)測方面等。    植物超氧化物

7、歧化酶的制備工藝，其主要目的是純化植物中的SOD，最大限度地清除雜蛋白，因此，常用的方法主要有熱變性法、等電點沉淀法、鹽析法、有機溶劑沉淀法、超濾法、層析法等2。而本文主要探究超氧化物歧化酶的制備工藝，比較幾種常用工藝，熱變性法和等電點沉淀法簡單，不需加其他試劑，但不能大幅度提高SOD的比活；鹽析法有利于保持蛋白質(zhì)的生理活性，但分辨率低3；離子交換層析主要用于高純度的SOD精品的制備，處理量小。本研究將幾種簡單工藝相結合，揚長避短，找出一套既簡便又能有效提高SOD純化倍數(shù)的方法。1  材料與方法1.1 材料與試劑黃瓜；氯化硝基四氮唑藍(NBT)、甲硫氨酸、二乙基氨基乙基纖維素(DEA

8、E)、四甲基乙二胺(TEMED)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(國藥集團化學試劑有限公司)、甲叉雙丙烯酰胺(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司)等化學試劑均為分析純；標準蛋白采用上海生物化學試劑公司產(chǎn)的牛血清白蛋白；考馬斯亮藍G-250(上?；瘜W試劑分裝廠)。1.2 儀器722光柵分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；DYY-2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋 JK-S26型(上海華聯(lián)醫(yī)療器械有限公司)；高速冷凍離心機D-37520(Osterode Kendro Laboratory Products)；LGJ-10冷凍干燥機(軍事醫(yī)學科學院實驗儀器廠研制，北京松源滑

9、行科技發(fā)展有限公司制造) ；HD-3紫外檢測儀(上海滬西分析儀器廠)；DHL-A電腦恒流泵(上海滬西分析儀器廠)；DBS-100電腦全自動部分收集器(上海滬西分析儀器廠)。1.3 方法將黃瓜用清水洗凈，稱取100 g，以1.51 比例3加入pH7.8，0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液150 ml，先加75 ml磷酸鹽緩沖液和少許石英砂，用高速組織搗碎機充分攪碎，在12 000 r/min，4離心40 min，使懸浮物完全沉淀，取沉淀再加入75 ml磷酸鹽緩沖液，冰浴充分研磨，并12 000 r/min，4下離心40 min，棄去沉淀，合并兩次上清液，制得粗酶液。將粗酶液靜置于55恒溫水浴鍋中

10、25 min，進行熱變性，使雜蛋白變性沉淀下來，再在4下12 000 r/min離心20 min，棄去沉淀，保留上清液。用0.1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)上清液，使其pH達到5.0，在4下12 000 r/min離心20 min，收集上清液。在上清液中加入固體硫酸銨粉末，使溶液達到45%的飽和度后，用玻璃棒攪拌30 min，然后冷藏靜置2h，再在4，12 000 r/min離心40 min，去除沉淀，取上清液；再加入固體硫酸銨粉末到90%飽和度，攪拌30 min，冷藏過夜，再在4，12 000 r/min離心60 min，取沉淀，溶解于pH7.8，0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，4透析過夜，待

11、上柱。    預先處理DEAE-纖維素，裝柱，將待上柱的酶液加入層析柱中，用pH7.8，0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，洗脫速度控制在3 ml/min，以每管3 ml收集洗脫物，收集70管，將收集SOD活性峰的部分合并，測定蛋白峰處各管的酶活力(U)及蛋白質(zhì)含量(mg)。將收集的酶液，4透析，再置于70冰箱中，冷凍過夜，用冷凍干燥機將酶液制成干粉，即為成品。1.4  SOD的鑒定本實驗采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)及SOD酶活性染色來鑒定純化物確為SOD4。1.5  超氧化物歧化酶(SOD)活力測定用NBT光還原法來測定超氧化物

12、歧化酶的活性，根據(jù)光照時體系中產(chǎn)生氧自由基使NBT還原成藍色甲簪(在560 nm處有一吸收峰)，而超氧化物歧化酶作為氧自由基的清除劑可抑制此反應。酶活性單位采用抑制NBT光還原50%為一個酶活性單位表示5。1.6  蛋白質(zhì)含量測定以考馬斯亮藍G250在595 nm波長下制作標準曲線，再進行樣品液中蛋白質(zhì)含量測定，根據(jù)所測定的A595值，在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，重復3次取平均值，通過計算求出樣品中蛋白質(zhì)含量(mg)。2 結果2.1  沉淀法分離SOD本實驗通過熱變性沉淀法、等電點沉淀法從黃瓜中分離SOD，在此過程中，熱變性溫度、pH的選擇均對分離提取SOD存在影響。    表1結果表明