熒光定量RT-PCR對(duì)水稻條紋病毒在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)分析

1、熒光定量RT-PCR 對(duì)水稻條紋病毒在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)分析1楊金廣，郭利娟，李冠義，吳祖建，謝聯(lián)輝福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所，福州（350002）水稻條紋葉枯病是東亞稻區(qū)主要的病毒病, 在我國溫帶和亞熱帶稻區(qū)發(fā)病尤為嚴(yán)重1-2，至今仍在江蘇、河南、安徽、山東、遼寧、云南、北京和浙江等地嚴(yán)重危害。引起該病的水稻條紋病毒（Rice stripe virus, RSV）是纖細(xì)病毒屬（Tenuivirus ）的代表種，是由灰飛虱（Laodelphax striatellus）傳播的，具有雙義編碼策略的負(fù)單鏈RNA 植物病毒。其基因組由4條RNA 組成，可編碼7個(gè)蛋白

2、，除RNA1負(fù)義編碼337 kDa的RNA 依賴的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）外3，RNA2、RNA3和RNA4均為雙義編碼，即在正義鏈和負(fù)義鏈各編碼一個(gè)蛋白。RNA2正義鏈和負(fù)義鏈分別編碼22.8 kDa的NS2蛋白和94 kDa的NSvc2蛋白4。RNA3正義鏈編碼一個(gè)23.9 kDa的NS3蛋白，負(fù)義鏈編碼一個(gè)35 kDa的核衣殼蛋白（coat protein, CP）5。RNA4正義鏈和負(fù)義鏈分別編碼20 kDa的病害特異性蛋白（disease-specific protein, SP）和32 kDa的蛋白NSvc46-7。目前

3、, 只有RdRp 、CP 和SP 3個(gè)基因功能初步確定 1，8-9，其它基因功能尚不明確。當(dāng)前，關(guān)于RSV 在水稻細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的研究?jī)H限于Yang et al. 10通過間接ELISA 對(duì)RSV CP 蛋白在水稻原生質(zhì)體內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。為了深入探討RSV 在水稻細(xì)胞內(nèi)的增值和基因表達(dá)的情況，我們應(yīng)用較ELISA 更準(zhǔn)確、精密和特異性的技術(shù)熒光定量RT-PCR ，對(duì)RSV 的7個(gè)基因在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的RNA 表達(dá)量的變化進(jìn)行了研究，以期能夠更加深入地揭示RSV 在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制變化，為進(jìn)一步研究RSV 復(fù)制、病毒粒體裝配以及基因功能提供科學(xué)依據(jù)。1材料與方法1.1 植物材料、病毒毒源和試

4、劑1本課題得到國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究規(guī)劃項(xiàng)目（973） （2006CB100203）、教育部博士點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20040389002； 20050389006；國家自然科學(xué)基金(30671357的資助。粳稻品種日本晴（Oryza sativa L. subsp. japonica cv. Nipponbare）為本研究所保存。病毒毒源采自江蘇洪澤水稻田間呈典型水稻條紋葉枯病癥狀的病株，經(jīng)RT-PCR 鑒定，分離純化后，經(jīng)灰飛虱傳毒并保存于水稻植株中（臺(tái)中1號(hào)）。發(fā)病病株用于RSV 提純11。RNA 提取試劑盒Trizol Reagent為美國Invitrogen 公司產(chǎn)品；TaKaRa EXScr

5、iptTM RT-PCR Kit購于大連寶生物生物工程有限公司；熒光定量PCR 儀MiniOpticon TM System系統(tǒng)為美國Bio-Rad 產(chǎn)品。1.2 水稻懸浮細(xì)胞培養(yǎng)與RSV 侵染水稻懸浮細(xì)胞培養(yǎng)與RSV 侵染參照Yang et al. 的方法10。RSV 侵染水稻懸浮細(xì)胞后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h取樣，置于80條件下保存?zhèn)溆没蛘咧苯舆M(jìn)行總RNA 提取。1.3 引物設(shè)計(jì)應(yīng)用PerlPrimer 軟件對(duì)RSV 7個(gè)基因的特異性引物進(jìn)行設(shè)計(jì)12。為保證所設(shè)計(jì)引物的特異性，所選引物均在GenBank 數(shù)據(jù)庫Blast 程序下進(jìn)行比較分析，以避免與水稻基因

6、組任何序列同源。RSV 7個(gè)基因和內(nèi)參基因水稻UBQ5基因的引物序列詳見表1。表1 引物序列及預(yù)測(cè)片段大小Table 1 Primers and predicted amplification sizeGene Forward sequence(53 Reverse sequence(53 size/bpNS2 GAGCCTACTACAAGCCACATCAGCCAACCAAGACATAGTCATCACTARG 132 NSvc2 CATCCTTCTTTCTCTAAGTTCGGTCTCAACAGCATACACTATTCCCA 194 NS3 CATCGTCTGTGGGTTCTGTG ATGCTC

7、ATCAATGGARGGGT 157 CP RTTGACAGACATACCAGCCAG CATCA TTCACTCCTTCCAAATAACY 243 SP TTGTCACTCMTTCCTATCTCAC TCTTCCACACTTTCTCATACTC 235 NSvc4 CAACCTCTCACYCATTACCC CGGACACTTGAAGATTATGCT 234UBQ513 ACCACTTCGACCGCCACTACTACGCCTAAGCCTGCTGGTT 69 R represent A or G；Y represent C or T；M represent A or C1.4 總RNA 提取與r

8、eal-time RT-PCR檢測(cè)取植物樣品0.1 g，于1 mL Trizol試劑中研磨，然后提取總RNA ，方法按公司提供的產(chǎn)品說明進(jìn)行。20 l 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中含：總RNA 1 g 、3端引物（10 pmol） 1 l 、5×ExscriptTM Buffer 4 l 、dNTP Mixture (各10 mmol/L 1 l 、Exscript TM RTase (200 U/l 0.5 l 、RNase Inhibitor (40 U/l 0.5 l ，最后用RNase Free dH2O 補(bǔ)足20 l 。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：42反應(yīng)15 min，95滅活2 min。取1

9、l cDNA溶液加入以下試劑：2×Premix Ex TaqTM 25 l 、3端引物和5端引物（10 pmol）各1 l 和dH 2O 22 l 。real-time PCR在50 l 反應(yīng)體系中，于48孔MiniOpticon TM System系統(tǒng)中進(jìn)行以下反應(yīng)。95預(yù)變性10 s后，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)為95變性6 s，62退火20 s。然后進(jìn)行融解曲線制作，Real-time RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性均通過1瓊脂糖凝膠電泳和每個(gè)基因的融解曲線進(jìn)行鑒定。用 EASY Dilution 將cDNA 溶液按40、41、42、43和44梯度稀釋后，各取1l 稀釋后的cDNA

10、 作為模板進(jìn)行real-time PCR靈敏性檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建。1.5 數(shù)據(jù)分析根據(jù)內(nèi)參基因的mRNA 的含量對(duì)所有樣品進(jìn)行歸一化處理（初始RNA 量校正），然后確定每個(gè)目的基因在不同樣品中的RNA 表達(dá)量。每個(gè)試驗(yàn)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，并至少進(jìn)行2次生物實(shí)驗(yàn)重復(fù)。利用t -test 對(duì)RSV 7個(gè)基因在RSV 侵染水稻懸浮細(xì)胞后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h的RNA 表達(dá)量變化的差異顯著性進(jìn)行分析。2結(jié)果分析2.1 RSV 7個(gè)基因的擴(kuò)增及其引物特異性的分析通過real-time RT-PCR對(duì)RSV 侵染后水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的RSV 7個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示從侵染初期

11、的0 h到侵染后60 h均能檢測(cè)到RSV 7個(gè)基因的存在。其中RdRp 片段為124 bp, NS2片段為132 bp，NSvc2片段為194 bp，NS3片段為157 bp，CP 片段為243 bp，SP 片段為235 bp，NSvc4片段為234 bp，內(nèi)參基因UBQ5片段69 bp，片段大小均與預(yù)期設(shè)計(jì)相符，電泳條帶單一（圖1）。并且這些基因的溶解曲線峰值單一（結(jié)果未顯示）。這些特征表明，該研究中所應(yīng)用的RSV 7個(gè)基因和內(nèi)參基因的引物均符合基于SYBR Green I染料法的熒光定量PCR 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。2.2 RSV 基因在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的RNA 表達(dá)量的變化M 12345678 10

12、00500100300bp圖1 RSV基因和內(nèi)參基因UBQ5的real-time RT-PCR產(chǎn)物Fig.1 The amplicons of RSV genes and internal control UBQ5 gene via real-time RT-PCR. M: 100 bp DNA ladder; 18: The amplicons of RdRp、NS2、NSvc2、NS3、CP 、SP 、NSvc4 and UBQ5 genes by real-timeRT-PCR in succession. 圖8 RSV基因和內(nèi)參基因UBQ5的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 The standard

13、 curves of RSV genes and UBQ5 gene. A: RdRp; B: NS2; C: NSvc2; D: NS3; E: CP; F: SP; G:NSvc4; H: UBQ5 圖8 RSV基因在病毒侵染后不同時(shí)間RNA 相對(duì)表達(dá)水平Fig.8 The variances of RNA expression for RSV genes at different time post-infection. A: RdRp; B: NS2; C:NSvc2; D: NS3; E: CP; F: SP; G: NSvc4.2.3 RSV基因在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的RNA 表達(dá)量變化顯著性分析表2 RSV基因在病毒復(fù)制過程中變化的差異顯著性Table 2 The different significances of RSV genesGene t P RdRp 0.050.025 NS2 1.43 0.400.20 NSvc2 2.27 0.100.05 NS3 1.56 0.200.10 CP 1.35 0.400.20 SP 1.71 0.200.10 NSvc42.040.100.053討論在RSV 侵染水稻懸浮細(xì)