直投式酸奶發(fā)酵劑菌株發(fā)酵制備工藝研究

1、直投式酸奶發(fā)酵劑菌株發(fā)酵制備工藝研究彭亞會(huì) 高學(xué)軍 * 劉營(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150030摘 要:對(duì) EZAL-MY96直投式酸奶發(fā)酵劑中分離出來的 3株乳酸菌利用 5L 發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵工藝研究,確 定 3株菌中每一菌株的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。結(jié)果表明:所獲得產(chǎn)品的活菌數(shù)均超過 1011cfu/g,活菌率均超 過 70%,達(dá)到國外同類產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果為直投式酸奶發(fā)酵劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的理論和實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)。關(guān)鍵詞:直投式酸奶發(fā)酵劑;菌株發(fā)酵;制備工藝Research on Fermental Preparations Techniques of Strains

2、 of Direct Vat SetPeng Ya-hui, Gao Xue-jun*, Liu Ying(Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China Abstract :Each of three lactic acid bacteria from EZAL-MY96 was cultured and fermental techniques were studied by experiments with 5

3、L fermentive vessel. Technique parameters of three lactic acid bacteria were determined. Results showed that viable counts of products by choosing freeze-dried protectors of all DVS exceeded 1011cfu/g and viable organism rates of three strains all exceeded 70%, this achieved to the same product inde

4、x of EZAI-MY96. The result of study provides an important method and experimental data for developing DVS starter.Key words: Direct Vat Set; Strains Fermentation; Prepared Technique中圖分類號(hào): Q933 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 : A國內(nèi)應(yīng)用于酸奶生產(chǎn)的直投式發(fā)酵劑(Direct Vat Set, DVS用量巨大,但全部依賴于 進(jìn)口 1 。隨著我國發(fā)酵乳制品工業(yè)的迅猛發(fā)展,已對(duì)乳酸菌的分離鑒定、增殖培養(yǎng)、凍干保 存等直投式酸奶

5、發(fā)酵劑制備技術(shù)的關(guān)鍵問題進(jìn)行了一定的研究與探討 2。積極篩選優(yōu)良菌 種、 建立直投式酸奶發(fā)酵劑制備技術(shù), 大力開發(fā)具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)質(zhì)直投式酸奶發(fā) 酵劑勢在必行。本實(shí)驗(yàn)對(duì)直投式酸奶發(fā)酵劑的發(fā)酵工藝中的關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行研究,利用 5L 發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā) 酵工藝研究, 確定從 EZAL-MY96直投式酸奶發(fā)酵劑中分離得到的3株乳酸菌中每一菌株的 最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。冷凍干燥后的3株乳酸菌按照一定的比例混合制備出優(yōu)質(zhì)的 DVS 。本 研究結(jié)果為直投式酸奶發(fā)酵劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的理論和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。1.材料與方法1.1材料本實(shí)驗(yàn)室保藏的乳酸菌單菌株(嗜熱鏈球菌 1株,以下簡稱球菌;保加利亞乳酸桿菌 2株

6、,以下簡稱桿菌 1和桿菌 2 2。麥芽汁(青島啤酒集團(tuán);番茄汁(本實(shí)驗(yàn)室自制; 脫脂粉(內(nèi)蒙古呼倫貝爾農(nóng)墾雪花乳業(yè)。PY 培養(yǎng)基; M17球菌半選擇培養(yǎng)基; MRS 桿菌半選擇培養(yǎng)基;復(fù)壯培養(yǎng)基 (乳球菌和 乳桿菌分別采用液體 M17培養(yǎng)基和液體 MRS 培養(yǎng)基見文獻(xiàn) 3;球菌工業(yè)化液體超濃縮培 養(yǎng)基;桿菌 1工業(yè)化液體超濃縮培養(yǎng)基;桿菌 2工業(yè)化液體超濃縮培養(yǎng)基見文獻(xiàn) 4。BIOF-2005型發(fā)酵罐, FD-1B-55型冷凍干燥機(jī),高壓滅菌器,超凈工作臺(tái),恒溫培養(yǎng) 箱,恒溫震蕩器。 1.2方法將 3株乳酸菌發(fā)酵后的發(fā)酵液在各自的生長曲線的最高值時(shí)取出,采用冷凍離心機(jī)在 4 20min ,轉(zhuǎn)速

7、為 6000r/min。離心后分別加入各自濕菌體量 2倍質(zhì)量的 3株乳酸菌特異性 凍干保護(hù)劑,其中凍干保護(hù)劑配方見文獻(xiàn) 4。冷凍干燥采用程序?yàn)?-40 凍干 20h ,凍干后利 用 -80 的低溫冰箱保存。測定 DVS 菌株在 5L 發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液總蛋白含量、甘油三酯含量變化情況, 測定培養(yǎng)液中乳酸含量變化情況, 具體步驟均按說明書進(jìn)行操作。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均測定 3個(gè)平行, 然后求平均值。根據(jù)確定的最佳工藝參數(shù)及生長曲線, 來確定3株菌的發(fā)酵過程中最佳攪拌速度。 球菌 生長的實(shí)驗(yàn)基本條件為:在 5L 發(fā)酵罐裝入 3.5L 增殖培養(yǎng)基,按 3%接種量接種,在不同轉(zhuǎn) 速下, 42 恒溫培養(yǎng) 6

8、h 終止,分別測定活菌數(shù)。桿菌 1生長的實(shí)驗(yàn)基本條件為:在 5L 發(fā)酵 罐裝入 3.5L 增殖培養(yǎng)基,按 3%接種量接種,在不同轉(zhuǎn)速下, 37 恒溫培養(yǎng) 8h 終止,分別 測定活菌數(shù)。桿菌 2生長的實(shí)驗(yàn)基本條件為:在 5L 發(fā)酵罐裝入 3.5L 增殖培養(yǎng)基,按 3%接 種量接種,在不同轉(zhuǎn)速下, 37 恒溫培養(yǎng) 14h 終止,分別測定活菌數(shù)。2. 結(jié)果與討論2.1生長曲線的確定根據(jù)3株菌在 5L 發(fā)酵罐中各自活菌計(jì)數(shù), 繪制出各自的生長曲線。 結(jié)果如圖 1、 圖 2。 12345678910培養(yǎng)時(shí)間 (h菌 數(shù) (1010c f u m l -1圖 1 球菌生長曲線 圖 2桿菌的生長曲線由圖 1

9、球菌的生長曲線可知,到 6h 左右活菌數(shù)達(dá)到最大值,因此發(fā)酵培養(yǎng) 6h 為球菌 的最佳收獲期,此時(shí)的發(fā)酵液活菌數(shù)為 1.52 1010cfu/mL;由圖 2桿菌 1、桿菌 2的生長曲 線可知 , 桿菌 1到 8h 左右活菌數(shù)達(dá)到最大值, 因此選擇發(fā)酵培養(yǎng) 8h 為其最佳收獲期, 此時(shí)的發(fā)酵液活菌數(shù)為 1.83 109cfu/mL;桿菌 2到 14h 左右活菌數(shù)達(dá)到最大值,因此選擇發(fā)酵 培養(yǎng) 14h 為其最佳收獲期,此時(shí)的發(fā)酵液活菌數(shù)為 1.72109cfu/mL。 2.2 DVS菌株的凍干效果球菌凍干后所得凍干粉的活菌數(shù)為 7.121011cfu/g,活菌率 71%;桿菌 1凍干后所得凍 干粉

10、活菌數(shù)為 2.101011cfu/g, 活菌率 81%; 桿菌 2凍干后所得凍干粉活菌數(shù)為 2.451011cfu/g, 活菌率 83%。由此可見,所獲得產(chǎn)品的活菌數(shù)均超過 1011cfu/g,活菌率均超過 70%,達(dá)到 國外同類產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)。2.3 DVS菌株發(fā)酵培養(yǎng)的生化特性有研究表明:球菌、桿菌 1和桿菌 2合成的乳酸是影響發(fā)酵液 pH 值的主要物質(zhì)。這與 趙鑫和 Shakeel UR等人的研究相一致 57。球菌、桿菌 1和桿菌 2的代謝產(chǎn)物乳酸的含量變 化見圖 3、圖 4。由圖 3可以看出:球菌在 12h 培養(yǎng)液中乳酸含量最高。由圖 4可以看出:桿菌 1在 10h 培養(yǎng)液中乳酸含量最高,

11、桿菌 2在 16h 培養(yǎng)液中乳酸含量最高,因此, 3株菌 合成乳酸的最大值時(shí)間均為對(duì)數(shù)生長期頂點(diǎn)后 2到 3h 。球菌、桿菌 1和桿菌 2在菌數(shù)達(dá)到 最高值時(shí),菌體還繼續(xù)合成乳酸, 2到 3h 后乳酸含量達(dá)到最高值,此后乳酸抑制了菌體的 增長。由圖 3、圖 4可知,球菌合成的乳酸量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于桿菌 1和桿菌 2,由此可知,球菌是 合成乳酸的重要來源。 906024乳 酸 含 量 (m m o l L -1圖 3 球菌乳酸含量變化 圖 4 桿菌乳酸含量變化球菌、桿菌 1和桿菌 2培養(yǎng)液甘油三酯的含量變化見圖 5。由圖 5可以看出,隨著培養(yǎng) 時(shí)間的延長, 3株菌培養(yǎng)液中甘油三酯的積累呈越來越多的趨勢,

12、可能與菌體合成甘油三酯 增多或菌體裂解釋放甘油三酯有關(guān)。 圖 5 三株乳酸菌甘油三酯含量變化球菌、桿菌 1和桿菌 2培養(yǎng)液中總蛋白的含量變化見圖 6。由圖 6可以看出,隨著培養(yǎng) 時(shí)間的延長, 3株菌培養(yǎng)液中的總蛋白呈升高的趨勢,這可能與菌體釋放蛋白質(zhì)增多以及菌 體裂解釋放產(chǎn)生蛋白質(zhì)多于原培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量有關(guān), 或者是培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)被降解產(chǎn)生 更多數(shù)量的小分子多肽,導(dǎo)致試劑盒檢測結(jié)果顯示更高數(shù)值的關(guān)系。 圖 6 三株菌培養(yǎng)液中總蛋白含量變化2.3攪拌轉(zhuǎn)速的測定發(fā)酵罐中培養(yǎng)的 3株菌攪拌轉(zhuǎn)速與對(duì)數(shù)生長期頂點(diǎn)時(shí)的活菌數(shù)之間的關(guān)系見圖 7、圖 8。 1.58攪拌轉(zhuǎn)數(shù) 1.180(rmin -1 活

13、菌 數(shù) (1010c f u m l -1f圖 7 攪拌轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)球菌活菌數(shù)的影響 圖 8 攪拌轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)桿菌的活菌數(shù)的影響 由圖 7、圖 8可以看出,球菌最佳攪拌度為 100r/min;桿菌 1的最佳攪拌度為 100110r/min;桿菌 2的最佳攪拌度為 110120r/min。由以上數(shù)據(jù),確定 3株菌的發(fā)酵工藝。將球菌菌種利用 PY 增殖培養(yǎng)基培養(yǎng) 8h 制備種 子液,將球菌的種子液按照 3%的接菌量接到已滅菌球菌廉價(jià)優(yōu)化培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)初始 pH 為 7.0后,發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為 100r/min,在 42 發(fā)酵 6h 后取出;將桿菌 1菌種利用 MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng) 23h 制備種子液,將桿菌

14、1的種子液按照 3%的接菌量接到已滅菌的桿菌 1廉價(jià) 優(yōu)化培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)初始 pH 為 6.26.4后,發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為 100110r/min,在 37 發(fā)酵 8h 后取出;將桿菌 2菌種利用 MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng) 23h 制備種子液,將桿菌 2的種子液 按照 3%的接菌量接到已滅菌的桿菌 2廉價(jià)優(yōu)化培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)初始 pH 為 6.26.4后,發(fā) 酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為 110120r/min,在 37 發(fā)酵 14h 后取出。將上述 3株乳酸菌取出后,均 采用冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心, 轉(zhuǎn)速為 6000r/min, 4 , 離心 20min 。 離心后分別加入 3株乳酸菌 濕菌體量 2倍質(zhì)量的各自的菌

15、株特異性凍干保護(hù)劑進(jìn)行凍干。 冷凍干燥采用程序?yàn)?40 凍 干 20h ,凍干后利用-80 的低溫冰箱保存。3.結(jié)論本實(shí)驗(yàn)獲得來自 EZAI-MY96中的3株乳酸菌各菌株的發(fā)酵制備工藝流程及最佳發(fā)酵工 藝參數(shù),為直投式酸奶發(fā)酵劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。3株乳酸菌的活菌數(shù)均在 1011cfu/g,活菌率均超過 70%,達(dá)到國外同類產(chǎn)品(EZAI-MY96的標(biāo)準(zhǔn)。參考文獻(xiàn)5趙鑫,趙良啟,謝紅.發(fā)酵生產(chǎn) L-乳酸的現(xiàn)狀與展望 J.山西化工. 2005, 25(1 .1519.6Frees D, Vogensen FK, Ingmer H. Identification of proteins induced at low pH in Lactococcus lactisJ. Int J Food Microbiol. 2003 11 1;87(3. 293300.7Shakeel UR, Farkye NY, Yim B. Use of dry milk protein concentrate in pizza cheese ma