造血細(xì)胞生長因子在臍血體外擴(kuò)增中作用研究的進(jìn)展

1、造血細(xì)胞生長因子在臍血體外擴(kuò)增中作用研究的進(jìn)展    【關(guān)鍵詞】 造血 摘 要：人臍血中造血干/祖細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，但單份臍血數(shù)量有限，因此目前臍血移植多用于低體重兒童。造血細(xì)胞生長因子具有促進(jìn)臍血擴(kuò)增的作用，在不同的造血細(xì)胞生長因子聯(lián)合作用下，可以有目的地進(jìn)行體外擴(kuò)增，從而使單份臍血有望解決高體重兒童及成人臍血移植存在的造血干/祖細(xì)胞數(shù)量不足的問題，為臍血廣泛應(yīng)用于臨床移植作出貢獻(xiàn)。 關(guān)鍵詞： 造血細(xì)胞生長因子； 臍血； 造血干/祖細(xì)胞； 體外擴(kuò)增    臍血干細(xì)胞移植的生物學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床移植治療近年來取得很大進(jìn)

2、展。自從1988年法國的Gluckman等首先成功移植治療Fanconi貧血后，世界各地相繼開展這方面工作，目前已成功用于治療血液系統(tǒng)惡性疾病、惡性實體瘤、遺傳性疾病等多種疾病，但因單份臍血可采量有限。Regidor1等報道單份臍血含有核細(xì)胞（nucleated cells, NC）和CD34 細(xì)胞分別為1.2×109和3.1×106。Gluckman2等認(rèn)為，臍血移植所需NC及CD34 細(xì)胞理想值應(yīng)分別達(dá)到3.7×107/kg和3×105/kg受者體重，故目前多用于兒童。因此體外擴(kuò)增臍血定向祖細(xì)胞同時維持干細(xì)胞的數(shù)量和活性，加快短期造血重建，是臍血移植

3、應(yīng)用于較大兒童和成人所面臨的關(guān)鍵問題，而造血細(xì)胞生長因子則是臍血體外擴(kuò)增必不可少的因素。因此，近十余年來，探討不同因子在臍血體外擴(kuò)增中的作用，尋求其合理有效的組合及擴(kuò)增時機(jī)等的研究備受關(guān)注，其研究成果也必將為臍血廣泛應(yīng)用于臨床做出貢獻(xiàn)。 1 臍血的生物學(xué)特性 11 造血干/祖細(xì)胞及表型標(biāo)記與檢測指標(biāo) 通過對人和鼠類造血干/祖細(xì)胞的研究證明，造血干細(xì)胞沒有特殊的形態(tài)學(xué)特征，它比中等大小圓形淋巴樣單核細(xì)胞略小，比重較輕。99.5%以上處于Go期，祖細(xì)胞比重稍大，它們在流式細(xì)胞儀上表現(xiàn)在低前角光散射和低到中度垂直光散射。在人類尚無檢測真正造血干細(xì)胞的方法，一般認(rèn)為體外長期培養(yǎng)的起始細(xì)胞（LTCIC）

4、或爆式集落形成單位（CFUBI）可代表干細(xì)胞的數(shù)量，而粒/紅/巨噬/巨核細(xì)胞集落形成單位（CFUGEMM）則代表多能造血祖細(xì)胞。目前人類造血干細(xì)胞的較完整的標(biāo)記應(yīng)該為：CD34 ，AC133 ，CD117 ，CD135 ，CD38- ，CD33- ，CD90low ，CD71-，HLA-DR- ，mCD45RAlow ，Lin- ，RH123low，HD33342low 。而最近的研究已有充分證據(jù)證明在CD34 細(xì)胞之前存在著CD34-的造血干細(xì)胞。 12 臍血干/祖細(xì)胞生物學(xué)特性 在胚胞發(fā)育過程中，造血干細(xì)胞是從卵黃囊全能間葉細(xì)胞分化而來的，胚胞發(fā)育至35月時，造血主要發(fā)生在肝臟和脾臟中，因

5、此其中含有大量的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞，雖然其中造血祖細(xì)胞的含量隨胎齡的增大而減少，但足月新生兒臍血中的含量較正常骨髓高，且更幼稚些，臍血中CD34 細(xì)胞含量約1%2%，研究還證實臍血中的造血干/祖細(xì)胞的增殖分化能力，體外集落形成能力，刺激后進(jìn)入細(xì)胞周期的速度，自泌生長因子的能力較骨髓和外周血中強(qiáng)3；他們的端粒及端粒酶也長于和高于骨髓和外周血的干/祖細(xì)胞，且低表達(dá)或不表達(dá)細(xì)胞凋亡配基CD95/Fas，移植后壽命更長；臍血造血干/祖細(xì)胞對多種造血生長因子刺激的反應(yīng)遠(yuǎn)強(qiáng)于骨髓及外周血的。因此，體外短期擴(kuò)增便可獲得大量造血細(xì)胞供成人移植。另一方面，臍血淋巴細(xì)胞和成人外周血淋巴細(xì)胞間存在許多量與質(zhì)的差異。

6、前者淋巴細(xì)胞數(shù)高于后者23倍，CD8 者比例低，其T細(xì)胞有未成熟的特性，缺乏T細(xì)胞活化/生長因子，抗原表達(dá)弱而不充分，自然殺傷（NK）細(xì)胞活性較多，對有絲分裂原PHA、CONA有較好的反應(yīng)，但對異基因抗原的反應(yīng)性差，這些免疫學(xué)特性有利于移植成功及成功后GVHD的發(fā)生率和程度均較骨髓和外周血干細(xì)胞移植者低。 2 造血細(xì)胞生長因子（HGFS）在臍血體外擴(kuò)增中的作用 21 造血細(xì)胞生長因子（HGFS）的分類 HGFS是對造血干/祖細(xì)胞的增殖和分化直接或通過輔助細(xì)胞釋放，其他細(xì)胞因子間接起調(diào)節(jié)作用的因子，根據(jù)其生物學(xué)活性，可分為4類：作用于干細(xì)胞和早期祖細(xì)胞的生長因子：如干細(xì)胞刺激因子（SCF/CKi

7、t配體），F(xiàn)it3配體（FL），基質(zhì)成纖維細(xì)胞因子（bFGF）、白細(xì)胞介素6（IL6），IL11及白血病細(xì)胞抑制因子（LIF）。其中IL6是對造血及免疫有多種功能作用的細(xì)胞因子。多系祖細(xì)胞刺激因子，如IL3及GMCSF等，它們主要刺激祖細(xì)胞的增殖與分化。作用于晚期（單向）祖細(xì)胞的造血生長因子，如紅細(xì)胞生成素（EPO），粒細(xì)胞刺激因子（GCSF），單核細(xì)胞系刺激因子（MCSF/Cfms 配體），IL5及血小板生成素（TPO）等，它們主要作用于單向造血祖細(xì)胞，供進(jìn)一步分化為各類前驅(qū)細(xì)胞和成熟細(xì)胞。然而其中一些也對早期或多向祖細(xì)胞有一定作用，如TPO對造血干/祖細(xì)胞也有直接刺激作用。造血細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)

8、控因子，如選擇性抑制造血祖細(xì)胞的T細(xì)胞生長因子（TGF），還有巨噬細(xì)胞炎性蛋白1（MIP1）、干擾素（IFN）、干擾素（IFN）、血小板第四因子（PF4）及腫瘤壞死因子（TNF）等。 22 造血生長因子的聯(lián)合應(yīng)用 實驗表明，造血生長因子是臍血體外擴(kuò)增的必要條件，而多因子聯(lián)合應(yīng)用的擴(kuò)增體系較單一細(xì)胞因子的擴(kuò)增體系效果大大增強(qiáng)，因此尋求合理有意義的細(xì)胞因子組合擴(kuò)增體系是關(guān)注的焦點。實驗研究表明，在一些細(xì)胞因子作用下，臍血的CD34 細(xì)胞經(jīng)12周培養(yǎng)即可使細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增301000倍，集落形成細(xì)胞擴(kuò)增41190倍，但是這些細(xì)胞因子的組合在擴(kuò)增細(xì)胞的同時也明顯加速了干/祖細(xì)胞的分化，目前研究的重點是如何

9、在擴(kuò)增造血細(xì)胞的同時，又盡可能的保留造血干細(xì)胞并擴(kuò)增早期造血祖細(xì)胞。 221 正調(diào)控因子的聯(lián)合使用：在擴(kuò)增體系的細(xì)胞因子組合中，必須包括有FL或SCF，F(xiàn)L與SCF同屬酪氨酸激酶受體TKR家族，通過其特異性TKR結(jié)合向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號，啟動早期祖細(xì)胞的分裂和增殖，促進(jìn)其生長，抑制凋亡，但兩者在人與鼠的HSCs表達(dá)有差異。Sitnicka E4等人的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)L比SCF對人的HSCs作用更強(qiáng)，而SCF比FL對鼠的HSCs作用強(qiáng)，實驗表明，臍血CD34 細(xì)胞在SCF IL3 IL6 GMCSF GCSF刺激下，有核細(xì)胞，CD34 細(xì)胞，CFUGM和LTCIC分別擴(kuò)增了2500，39，49和2.5

10、倍5。Kogler6等對不同的因子組合進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)臍血CD34 細(xì)胞在SCF FL IL3組合中獲得CFUGFMM的最大擴(kuò)增（94倍），如再加入GMCSF，EPO等系特異性因子，只能增加CFC和NC總數(shù)，而CFUGEMM無明顯增加，新近研究表明，F(xiàn)L、SCF、TPO是擴(kuò)增早期干/祖細(xì)胞必不可少的。NgYY7等認(rèn)為，F(xiàn)L、TPO、SCF是體外擴(kuò)增早期干/祖細(xì)胞的最強(qiáng)因子，在他們的實驗研究中，三者聯(lián)用CD34 CD38-細(xì)胞擴(kuò)增了80120倍，且在體內(nèi)能繼續(xù)分化為各類細(xì)胞。國內(nèi)唐瑟8等研究亦表明三者聯(lián)用較單一應(yīng)用效果顯著，且能維持再造血能力。臍血造血細(xì)胞擴(kuò)增研究中，血小板生成素（TPO）的作用越

11、來越受到重視，TPO與SCF、IL3或FL聯(lián)合可加速靜止期的細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，也可維持原始造血細(xì)胞存活并抑制其凋亡，有人聯(lián)用FL和TPO能維持臍血CD34 細(xì)胞持續(xù)生長和擴(kuò)增超過6個月，CFUGM可增加200萬倍，而LTCIC擴(kuò)增了20萬倍，說明該因子組合既保持自我更新能力又極大地擴(kuò)增了造血細(xì)胞9。IL3的作用仍存在爭議，Bruno S10等應(yīng)用TPO FL SCF加IL3或IL6對臍血進(jìn)行體外擴(kuò)增，研究中發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增8周時CD34 細(xì)胞數(shù)量明顯增加，但LTCIC在6周時即開始下降并消失，擴(kuò)增細(xì)胞再植入NOD/SCID鼠6周時基本觀測不到，提示IL3未促進(jìn)UCBHSC的擴(kuò)增，并影響擴(kuò)增細(xì)胞再植入

12、能力。而Robmanith11用FL、SCF、TPO和IL3不同組合對臍血CD34 細(xì)胞進(jìn)行無血清體外細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)7天，在有或無IL3的情況下CD34 臍血細(xì)胞分別增加（20.9±5.4）倍和（9.3±3.2）倍，LTCIC分別增加了（16.3±5.5）倍及（12.6±5.6）倍，定向克隆形成細(xì)胞分別增加（18.1±2.4）倍和（9.1±2.0）倍，再用擴(kuò)增細(xì)胞及未擴(kuò)增細(xì)胞植入亞致死量照射的NSD/SCID鼠6周后發(fā)現(xiàn)：IL3促進(jìn)了UCBHSC的擴(kuò)增，且并不損害擴(kuò)增細(xì)胞的再植入能力。臍血造血細(xì)胞可通過選擇適當(dāng)?shù)囊蜃咏M合以實現(xiàn)某類細(xì)胞

13、的定向擴(kuò)增，巨核系定向擴(kuò)增的臨床意義尤為重要，亦為研究的熱點。Tao等12單用TPO對臍血CD34 細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)14天時，CD41 CD14細(xì)胞含量擴(kuò)增了27250倍，但大部分CD41 細(xì)胞為不成熟的二倍體。國內(nèi)學(xué)者莫文健13等聯(lián)用IL3、IL6、SCF與TPO對臍血CD34 細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，10天時CFUMK有最大程度的擴(kuò)增（6.8倍），而且CD41 細(xì)胞產(chǎn)量亦最高，且巨核細(xì)胞成熟良好。Shaw PH等14用IL3、TPO、SCF、FL、加GMSCF或EPO或二者均不加對臍血進(jìn)行擴(kuò)增，16天后，三組均得到了有效擴(kuò)增，但加GMCSF與EPO組與不加者無明顯差別，提示IL3、TPO、SCF、

14、FL4種因子組合即可有效擴(kuò)增巨核子，而GMCSF、EPO對擴(kuò)增無益。Proulx C15等用TPO、FL、SCF對巨核因子進(jìn)行擴(kuò)增，再向擴(kuò)增后的細(xì)胞體系中加SCF、FL、TPO、IL6進(jìn)行第二次擴(kuò)增，結(jié)果顯示細(xì)胞數(shù)增加了300倍，且獲得了大量的成熟的多倍體。    222 造血負(fù)調(diào)控因子的應(yīng)用 目前基礎(chǔ)與臨床研究的重點多用正調(diào)控因子組合來進(jìn)行臍血的擴(kuò)增，而造血負(fù)調(diào)控因子是維持正常造血不可或缺的細(xì)胞因子，近年來受到更多研究者的關(guān)注：TGF目前認(rèn)為是作用最強(qiáng)的一種負(fù)調(diào)控因子，研究表明，通過消除抑制因子作用可提高擴(kuò)增效果。Gardon用抗TGF1的抗血清或反義

15、TGF1寡核苷酸來阻斷臍血細(xì)胞自身分泌TGF1的抑制作用，從而促進(jìn)臍血CD34 CD38細(xì)胞增殖，國內(nèi)學(xué)者也對此作了研究。吳英理16等應(yīng)用MIP1及TGF抗體作為造血負(fù)調(diào)控因子的拮抗劑，改善了基質(zhì)體系的擴(kuò)增效果，而且兩者聯(lián)合應(yīng)用，擴(kuò)增效果明顯。但新近郝思國17等研究表明，高濃度的TGF1對造血細(xì)胞的增殖有明顯的抑制的作用，而低濃度的TGF1對各種細(xì)胞的擴(kuò)增抑制并不明顯，提示擴(kuò)增中應(yīng)用適當(dāng)濃度的TGF1不僅不影響造血細(xì)胞的擴(kuò)增，而且能明顯延緩和減少造血祖細(xì)胞在擴(kuò)增的分化，明顯地提高擴(kuò)增細(xì)胞中造血祖細(xì)胞的含量。TNF作為另一種負(fù)調(diào)控因子，Xiao w18 等的研究結(jié)果表明， TNF對造血細(xì)胞有直接

16、抑制作用。另有研究表明TNF對造血細(xì)胞的擴(kuò)增與其濃度有密切關(guān)系，低濃度時有刺激造血細(xì)胞增殖的作用。國內(nèi)錢文斌19等應(yīng)用TNF與細(xì)胞因子聯(lián)合，CD34 細(xì)胞細(xì)胞總數(shù)和CFC數(shù)分別是對照組的（17±3）倍和（8±2）倍，在無TNF體系中，擴(kuò)增高峰在第34周，而含有TNF的培養(yǎng)體系第2周造血細(xì)胞顯著增殖，表明TNF能加快CD34 細(xì)胞的增殖和分化。 目前對造血負(fù)調(diào)控因子在臍血體外擴(kuò)增中的應(yīng)用已受到關(guān)注，但因造血調(diào)控的復(fù)雜性，其研究還有待進(jìn)一步深入，但將正負(fù)調(diào)控因子聯(lián)合應(yīng)用，尋求合理組合，選用合適劑量必將為臍血體外擴(kuò)增研究帶來更光明的前景。   

17、60;23 擴(kuò)增時間 從臨床應(yīng)用來看，以短期培養(yǎng)為宜，邱蓮女20等用GCSF、GMCSF、IL3、IL6，SCF及EPO聯(lián)合組合長期培養(yǎng)MNC并進(jìn)行動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，造血干/祖細(xì)胞在培養(yǎng)7天最多，14天開始下降，提示臍血體外擴(kuò)增時間以714天為宜。 3 展望 隨著臍血造血干細(xì)胞基礎(chǔ)研究的深入，特別是體外培養(yǎng)技術(shù)的飛速發(fā)展，在造血細(xì)胞因子作用下單份臍血經(jīng)體外擴(kuò)增后用于高體重兒童及成人移植已成為現(xiàn)實，但還有許多問題有待于進(jìn)一步探討，如什么樣的細(xì)胞因子組合可作為最佳的擴(kuò)增體系？造血負(fù)調(diào)控因子如何更好地與正調(diào)控因子聯(lián)合對臍血進(jìn)行體外擴(kuò)增，擴(kuò)增后細(xì)胞的生物學(xué)免疫學(xué)特性是否有改變等等，這些都將是今后工作研究中

18、需進(jìn)一步探討的問題。 參 考 文 獻(xiàn) 1 Regidor C，Posada M，Monteagudo D，et al，Umbilical cord blood banking for unrelated transplantation: evaluation of cell separation and storage methods. EXP Hematol,1999,27(2):380385. 2 Gluckman E,Rocha V, Boyer chammardA, et al.Outcome of cord blood transplantation from related and

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