雷帕霉素對(duì)糖尿病腎病大鼠病理結(jié)構(gòu)及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

1、雷帕霉素對(duì)糖尿病腎病大鼠病理結(jié)構(gòu)及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響         10-09-12 16:46:00     作者：李琳琳 盧衡 鄭祥雄    編輯：studa20【摘要】  目的 觀察雷帕霉素對(duì)糠尿病腎病(DN)的保護(hù)作用。方法 應(yīng)用鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型。24只SD大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、糖尿病組、雷帕霉素組。第5周起雷帕霉素組予雷帕霉素1 mg·kg-1·d-1干預(yù)8 w

2、。12 w末觀察各組大鼠血糖、內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)、24 h尿微量白蛋白(24hUalb)、腎重/體重等的變化。光鏡觀察腎組織病理變化并測(cè)定腎小球平均體積及系膜基質(zhì)擴(kuò)張指數(shù)(EMMI)。RTPCR及免疫組化法檢測(cè)腎皮質(zhì)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，糖尿病組及雷帕霉素組大鼠血糖、Ccr、24hUalb均顯著上升,大鼠腎臟明顯肥大，腎小球平均體積、EMMI、毛細(xì)血管基底膜厚度均顯著增加;腎皮質(zhì)CTGFmRNA及蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。雷帕霉素干預(yù)后，上述指標(biāo)除血糖外均部分被抑制。結(jié)論 小劑量雷帕霉素能夠減輕腎臟肥大，抑制系膜外基質(zhì)聚集，下調(diào)CTGF的表達(dá)，延緩D

3、N的進(jìn)展。 【關(guān)鍵詞】  雷帕霉素;哺乳動(dòng)雷帕霉素靶蛋白;結(jié)締組織生長(zhǎng)因子;糖尿病腎病糖尿病腎病(DN)是糖尿病的主要微血管病變，是糖尿病的主要死亡原因之一。早期DN主要表現(xiàn)為腎小球及腎小管的肥大、基底膜的增厚、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的異常聚集。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(TGF1)下游的一個(gè)生物效應(yīng)因子，在DN腎小球肥大及ECM的異常聚集中均發(fā)揮重要作用。雷帕霉素是一種免疫抑制劑。近年研究提示，雷帕霉素對(duì)某些慢性腎臟疾病可能具有治療的潛力。雷帕霉素能抑制單腎切除所誘導(dǎo)的殘余腎臟肥大1，還能抑制系膜細(xì)胞增殖及型膠原的合成2。由于單側(cè)腎切除所致代償性腎肥大與糖尿病狀態(tài)下

4、腎肥大具有一定相似性，并且系膜細(xì)胞的增殖及ECM的聚集都是DN發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此，本課題擬用雷帕霉素進(jìn)行干預(yù)治療，觀察其對(duì)早期DN病理變化的影響及對(duì)CTGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響。1 材料與方法1.1 材料0003)。HRP多聚體(二步法免疫組化試劑)、DAB(均系北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品);Trizol(美國(guó)Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、10×緩沖液、dNTP(均系Fermentas公司產(chǎn)品);CTGF、actin引物(上海鼎安生物科技有限公司合成)。1.2 方法ProPlus6.0)計(jì)算每個(gè)正切腎小球的面積(AG)。利用公式計(jì)算其體積(

5、VG)。VG=(B/K)×(AG)1，3(B是理想化的球性腎小球系數(shù)B=1.38;K是腎小球大小分布系數(shù)，K=1.10)，最后求20個(gè)小球此比值的均數(shù)，即為每張切片腎小球的面積、體積值。同樣方法下分析PASM切片，計(jì)算每張切片的系膜基質(zhì)擴(kuò)張指數(shù)(MMEI)MMEI=腎小球PASM染色陽(yáng)性面積/腎小球正切面積。電鏡觀察腎小球?yàn)V過(guò)屏障及腎小管病變情況。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以x±s表示，SPSS11.0軟件包用單因素方差分析，方差齊者組間比較用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用GamesHowell檢驗(yàn)。     10-09-12 16:46:0

6、0     作者：李琳琳 盧衡 鄭祥雄    編輯：studa202 結(jié) 果2.1 一般生化指標(biāo) 雷帕霉素組及糖尿病組較對(duì)照組體重減輕，血糖、尿量明顯增加(均P<0.01)，24hUalb、體重校正的Ccr也明顯升高，表明DN建模成功。雷帕霉素組24hUalb、Ccr較糖尿病組顯著降低(P<0.01，P<0.05)。雷帕霉素組與糖尿病組大鼠血糖、尿量比較差異不顯著，見表1。2.2 腎組織病理檢查結(jié)果 與對(duì)照組相比，糖尿病組腎重/體重顯著增大，雷帕霉素組腎重/體重較糖尿病組減小，但還未降至對(duì)照組水平

7、。HE切片上，糖尿病組較對(duì)照組大鼠腎小球明顯增大，伴球囊腔擴(kuò)大。糖尿病組腎小球正切面積、腎小球體積較對(duì)照組明顯增大(P<0.01)，雷帕霉素組此兩項(xiàng)指標(biāo)較糖尿病組顯著降低(P<0.01)。見表2。PASM切片上，糖尿病組腎小球系膜區(qū)基質(zhì)增生，系膜區(qū)擴(kuò)大。MMEI較對(duì)照組增大，雷帕霉素組MMEI較糖尿病組降低(均P<0.01)，見圖1。電鏡檢查：與對(duì)照組相比，糖尿病組毛細(xì)血管基底膜出現(xiàn)節(jié)段性增厚，足突大量融合，雷帕霉素組基底膜增厚較糖尿病組減輕，仍可見足突融合。見圖2。2.3 CTGF在腎組織的定位和表達(dá) 免疫組化顯示CTGF主要表達(dá)于腎小球上皮細(xì)胞，在球旁和腎小管區(qū)間質(zhì)細(xì)胞及

8、管旁毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞也有微量表達(dá)。與對(duì)照組相比，糖尿病CTGF蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，雷帕霉素組CTGF表達(dá)較糖尿病組下調(diào)(P<0.01)。見表3，圖3。2.4 腎組織中CTGFmRNA的表達(dá) 如圖所示，對(duì)照組大鼠腎皮質(zhì)區(qū)CTGF低表達(dá)，與對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠出現(xiàn)CTGFmRNA高表達(dá)(P<0.01)，雷帕霉素組CTGFmRNA的表達(dá)量顯著低于糖尿病組(P<0.01)，但其表達(dá)仍然高于對(duì)照組(P<0.01)，見表3，圖4。表1 各組大鼠生化指標(biāo)變化與對(duì)照組比較：1)P<0.01;與糖尿病組比較：2)P<0.01,3)P<0.05，下

9、表同表2 各組大鼠腎小球平均面積、體積、MMEI的變化表3 各組大鼠腎小球CTGF平均光密度及mRNA比較3 討 論本研究觀察到，12 w末糖尿病組及雷帕霉素組大鼠均出現(xiàn)腎臟肥大，表現(xiàn)為腎重/體重明顯增大，腎小球正切面積、體積較對(duì)照組顯著增大(P<0.01)。由此，證實(shí)早期DN腎小球病理變化主要表現(xiàn)為肥大?？梢鹉I小球肥大的情況有多種，包括了腎小球固有細(xì)胞的增殖、腎小球固有細(xì)胞的體積增大及ECM的異常聚集。體外研究認(rèn)為，糖尿病早期腎臟肥大常有短暫的細(xì)胞增殖，隨后是較長(zhǎng)時(shí)間的腎臟細(xì)胞的體積增大和代謝亢進(jìn)4。近期的一些研究表明PI3K/AKT/mTOR通路的調(diào)控失常在糖尿病狀態(tài)下腎臟肥大中發(fā)

10、揮了一定的作用。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)又稱為蛋白激酶B(PKB)位于哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的上游。營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)因子信號(hào)激活PI3K，進(jìn)而導(dǎo)致AKT活化，AKT活化直接激活mTOR，mTOR通過(guò)磷酸化其下游的兩個(gè)效應(yīng)因子P70S6K及4EBP1，從而啟動(dòng)翻譯過(guò)程，促進(jìn)RNA和蛋白質(zhì)的合成5。大量蛋白質(zhì)物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的堆積，造成蛋白質(zhì)/DNA比例失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞肥大。Nagai研究3高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞肥大的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)系膜細(xì)胞中AKT及mTOR是被激活的。雷帕霉素進(jìn)入細(xì)胞后，與其胞漿受體FK506結(jié)合蛋白12相結(jié)合形成藥物受體復(fù)合物，能與mTOR相互作用

11、，抑制P70S6K的活化和4EBP1的磷酸化，從而抑制RNA和蛋白質(zhì)的合成。本研究表明，糖尿病大鼠經(jīng)過(guò)8 w的雷帕霉素治療后，腎臟肥大明顯改善，大鼠24 h尿蛋白排泄量及內(nèi)生肌酐清除率也較糖尿病組明顯下調(diào)。因此，雷帕霉素抑制腎小球細(xì)胞肥大可能是其延緩DN進(jìn)展的機(jī)制之一。CTGF是TGF1的下游調(diào)節(jié)因子,介導(dǎo)及增強(qiáng)了TGF1的促纖維化效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)顯示,在高糖、機(jī)械張力,血管緊張素、晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)和TGF1下,CTGF在腎臟細(xì)胞表達(dá)均明顯增加。激活的CTGF進(jìn)而促進(jìn)(Col、Col、Col、FN)的合成6。本研究表明糖尿病組大鼠不僅24hUalb、Ccr顯著升高，CTGF表達(dá)水平及

12、MMEI均較對(duì)照組也顯著上調(diào)，證實(shí)CTGF在DN腎小球纖維化中的作用。Biecker7利用膽管切除誘導(dǎo)膽汁性肝硬變大鼠模型，雷帕霉素治療28 d能有效減輕肝纖維化，減少肝臟TGF1、CTGF 及 PDGF的表達(dá)，其減輕肝纖維化程度與減少促纖維化因子表達(dá)水平相關(guān)。Lock的研究2發(fā)現(xiàn)，低劑量的雷帕霉素不僅抑制系膜細(xì)胞的增殖，還能抑制型膠原的分泌。Poulalhon等8利用人肺成纖維細(xì)胞研究雷帕霉素的抗纖維化作用。結(jié)果表明，雷帕霉素能夠劑量、時(shí)間依賴性的減少型及型膠原的mRNA及蛋白水平。同時(shí)雷帕霉素還能顯著的增加膠原酶MMP1的表達(dá)，證實(shí)雷帕霉素具有直接的抗纖維化效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，利用小劑量雷帕

13、霉素干預(yù)DN大鼠8 w，能顯著下調(diào)CTGFmRNA及蛋白表達(dá)，減小MMEI，抑制系膜基質(zhì)擴(kuò)張。因此，抑制CTGF表達(dá)是雷帕霉素延緩DN的另一可能機(jī)制。在本研究中雷帕霉素對(duì)大鼠血糖沒有明顯影響，可見雷帕霉素并非通過(guò)對(duì)血糖的調(diào)控可來(lái)影響疾病的進(jìn)程?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Chen JK，Chen J，Neilson EG,et al.Role of mammalian target of rapamycin signaling in compensatory renal growthJ.J Am Soc Nephrol，2005;16(5):138491.2 Lock HR，Sacks SH

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