加減三甲散及其拆方對(duì)肝纖維化大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

1、加減三甲散及其拆方對(duì)肝纖維化大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響 作者：?jiǎn)涛妇?楊宇 周新穎 袁建 劉旺華 閆穎 【摘要】 目的 通過(guò)觀察加減三甲散及其拆方對(duì)肝纖維化大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響，部分闡明本方及拆方治療肝纖維化的機(jī)理。 方法 使用四氯化碳誘導(dǎo)復(fù)制大鼠肝纖維化模型，觀察各組對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 各治療組均能顯著降低凋亡細(xì)胞數(shù)，與模型組比較，差異有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。結(jié)論 加減三甲散及其拆方能夠通過(guò)降低細(xì)胞凋亡對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化起到一定的治療作用。 【關(guān)鍵詞】 加減三甲散 滋陰 肝纖維化 肝細(xì)胞 凋亡 【Abstract】 Objective: To partly clarify the

2、mechanism of Modified San Jia Powder and its Sub-Formulas on hepatic fibrosis by observing the Effects of them on hepatic cell Apoptosis of rats with hepatic fibrosis. Methods: Using CCl4 to copy the hepatic fibrosis model in rats, and hepatic cell Apoptosis is tested. Results: All the therapeutic g

3、roups can decrease the level of Apoptosis（P0.01）。 Conclusion: Modified San Jia Powder and its Sub-Formulas have the effects on experimental hepatic fibrosis by lowering the level of Apoptosis. 【Key words】 Modified San Jia Powder Yin-enriching hepatic fibrosis hepatic cell Apoptosis 肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展過(guò)程中的

4、共同病理表現(xiàn)，是慢性肝病向肝硬化發(fā)展中的主要中間環(huán)節(jié)1?！翱托敖还逃谘}，主客交渾，最難得解，久而愈固，治法當(dāng)乘其大肉未消、真元未敗，急用三甲散，多有得生者”。三甲散乃吳又可創(chuàng)制，加減三甲散為本課題組在三甲散的基礎(chǔ)上加以調(diào)整，為臨床上治療肝病的經(jīng)驗(yàn)方。本實(shí)驗(yàn)在“主客交”理論指導(dǎo)下，通過(guò)觀察加減三甲散及其拆方對(duì)肝纖維化大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響，探討該方治療肝纖維化的機(jī)理。 1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠 體重180200g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 (1)加減三甲散及其拆方組水煎液(全方組藥物:龜板15g、穿山甲10g、僵蠶10g、蟬蛻5g、鱉甲15g、土鱉蟲(chóng)

5、10g、桃仁10g、當(dāng)歸10g、柴胡10g、白芍10g、甘草5g；滋陰組藥物：鱉甲15g、龜板15g、當(dāng)歸10g、白芍10g、甘草5g；去滋陰藥組藥物：穿山甲10g、僵蠶10g、蟬蛻5g、土鱉蟲(chóng)10g、桃仁10g、柴胡10g) 購(gòu)自北京同仁堂成都分店。以上藥物經(jīng)加水浸泡、常規(guī)煎煮、過(guò)濾及水浴蒸發(fā)制成每毫升含1g生藥的水煎液（濃度100），高溫滅菌后4冰箱保存?zhèn)溆谩?（2）秋水仙堿片：云南植物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，0.5mg/片，批號(hào)：20080701，0.5mg溶于10ml蒸餾水配成懸濁液，4冰箱保存?zhèn)溆谩?1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 （1）四氯化碳分析純專用試劑 純度99.5% 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB/T688-1

6、992 密度1.5921.598(20)四川航嘉生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司 批號(hào)：20080128，常溫保存?zhèn)溆谩?（2）魯花花生油 山東魯花集團(tuán)有限公司，批號(hào)：3700116036。 （3）TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒：美國(guó)ROCH公司產(chǎn)品。 1.4實(shí)驗(yàn)儀器 顯微鏡（LEICA DM 4000B）。 2 實(shí)驗(yàn)方法 110只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、病理模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、加減三甲散組、滋陰組、去滋陰藥組，除正常對(duì)照組為10只外，其余各組各20只。除正常組外，其余各組均用四氯化碳腹腔注射造模，0.2ml/100g，首次0.5ml/100g，2次/周，共8周。加減三甲散組、滋陰組、去滋陰藥組造模同時(shí)給予

7、藥物治療，每天上午8點(diǎn)灌胃，連續(xù)8周。給藥劑量按有關(guān)成人日用量與大鼠的體重體表面積比折算為等效劑量分別灌胃給予相應(yīng)藥物，陽(yáng)性對(duì)照組予秋水仙堿水溶液0.510-3g/kg，加減三甲散組給予加減三甲散浸膏11g生藥/kg，滋陰組給予滋陰藥物浸膏5.5g生藥/kg，去滋陰藥組給予去滋陰藥物5.5g生藥/kg。正常對(duì)照組和病理模型組給予等容積生理鹽水。共給藥8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，除空白對(duì)照組外，其余各組隨機(jī)挑選10只大鼠放血處死后,取肝臟組織用中性甲醛固定,石蠟包埋、切片,采用末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡,具體步驟按試劑盒要求進(jìn)行。以細(xì)胞核呈棕黃色著色為陽(yáng)性染色細(xì)

8、胞，胞核無(wú)棕黃色著色為陰性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野（高倍鏡下）記數(shù)，取平均值為該片凋亡細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 模型組大鼠凋亡細(xì)胞數(shù)高于空白對(duì)照組，差異有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），各治療組均能顯著降低凋亡細(xì)胞數(shù)，與模型組比較，差異有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。加減三甲散拆方組（滋陰組與去滋陰藥組）與加減三甲散組比較，差異仍然有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。 4 討論 細(xì)胞凋亡(Apoptosis)即程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death, PCD)，為非溶酶體核酸內(nèi)切酶把細(xì)胞DNA切割成寡核苷酸體片斷，繼而使細(xì)胞裂解

9、為凋亡小體。肝細(xì)胞凋亡是慢性肝病的一種重要病理改變, 與肝纖維化密切相關(guān)2。Takehara等發(fā)現(xiàn)抗凋亡因子BclXL敲除小鼠在肝細(xì)胞持續(xù)凋亡6個(gè)月后可形成肝纖維化，并且認(rèn)為肝細(xì)胞凋亡能夠?qū)е吕w維化3。本實(shí)驗(yàn)各治療組均能顯著降低凋亡細(xì)胞數(shù)，說(shuō)明加減三甲散及其拆方能夠通過(guò)降低細(xì)胞凋亡對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化起到一定的治療作用。 肝纖維化現(xiàn)代病理認(rèn)為，在病毒等多種因素作用下，肝炎病毒等整合于宿主肝細(xì)胞、免疫復(fù)合物形成、誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)等，激發(fā)HSC，誘發(fā)纖維化病變，并伴隨微循環(huán)障礙和血流動(dòng)力學(xué)異常。而“主客交”病理狀態(tài)則認(rèn)為久病陰精耗傷，邪氣滯留，絡(luò)脈瘀阻。加減三甲散全方透邪通絡(luò)、滋陰養(yǎng)血，正邪兼顧，其中穿山甲、龜板、僵蠶、蟬蛻、土鱉蟲(chóng)為異類靈動(dòng)之品，善通絡(luò)，直入厥陰肝絡(luò)，搜邪化瘀通絡(luò)；桃仁、當(dāng)歸辛潤(rùn)通絡(luò)；鱉甲、龜板、當(dāng)歸、白芍、甘草滋陰養(yǎng)血；柴胡疏肝行氣確為治療肝纖維化的有效方劑。 課題來(lái)源：四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目(課題編號(hào)：2008JY0084) 參 考 文 獻(xiàn) 1 程明亮，楊長(zhǎng)青，劉三都等.肝纖維化的基礎(chǔ)研究及臨床M.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996，17，183186. 2 周滔，劉成海.肝細(xì)胞凋亡在肝纖維化中的作用J.肝臟，2007，l2(6):503-505. 3 Takehara T，Tatsumi T，Su