微生物實(shí)驗(yàn)思考題參考答案及知識(shí)要點(diǎn)

1、二. 細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色1. 革蘭氏染色中那一步是關(guān)鍵?為什么?你是如何操作的?革蘭氏染色的關(guān)鍵步驟是:乙醇脫色(是脫色時(shí)間。如果脫色過(guò)度,革蘭氏陽(yáng)性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為是革蘭氏陰性菌;如脫色時(shí)間過(guò)短,革蘭氏陰性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為是革蘭氏陽(yáng)性菌。脫色時(shí)間的長(zhǎng)短還受涂片的厚薄,脫色是玻片晃動(dòng)的快慢及乙醇用量的多少等因素的影響,難以嚴(yán)格規(guī)定(脫色是應(yīng)當(dāng)控制速度,脫色時(shí)間一般為2030s。2.固定的目的之一是殺死菌體,這與自然死亡的菌體有何不同?自然死亡的菌體本身已經(jīng)部分自溶,結(jié)構(gòu)已經(jīng)改變。固定殺死細(xì)菌時(shí)細(xì)菌結(jié)構(gòu)是保持死亡時(shí)的狀態(tài)的。3. 不經(jīng)復(fù)染這一步能否區(qū)分革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌?能

2、。在酒精脫色后,不被酒精脫色而保留紫色者為革蘭氏陽(yáng)性菌(G+,被酒精脫色為革蘭氏陰性菌。最后一步用番紅染液復(fù)染,是為了讓結(jié)果更清楚。4.涂片為什么要固定,固定適應(yīng)注意什么問(wèn)題?a 殺死細(xì)菌并使菌體黏附與玻片上;b 增加其對(duì)染料的親和力。固定時(shí)應(yīng)注意:手持玻片,菌膜朝上,在微火過(guò)3次(手指觸摸玻片反面,不燙手為宜,固定時(shí)應(yīng)盡可能維持細(xì)胞原有形態(tài),防止細(xì)胞膨脹或收縮。三. 霉菌、放線菌的形態(tài)觀察1. 鏡檢時(shí),如何區(qū)分基內(nèi)菌絲與氣生菌絲?一般氣生菌絲顏色較深,直生或分枝絲狀,比基內(nèi)菌絲粗;而基內(nèi)菌絲色淺、發(fā)亮,可看到橫隔膜,繼而斷裂成球狀或桿狀小體。2. 顯微鏡下細(xì)菌放線菌酵母菌和霉菌的主要區(qū)別是什

3、么?放線菌與細(xì)菌需要在油鏡下才能觀察清楚,而霉菌和酵母菌在低倍鏡下即可看到。細(xì)菌:為細(xì)而短的單細(xì)胞微生物(個(gè)體微小,主要形態(tài)有:球、桿、螺旋狀等。(部分桿菌還可形成芽孢放線菌:存在分枝絲狀體和菌絲體,革蘭氏陽(yáng)性菌,有孢子絲和孢子(球形、橢圓形、桿狀、柱狀。酵母菌:單細(xì)胞,菌體呈圓球、卵形或橢圓形,少數(shù)呈檸檬形、尖形等。菌體比細(xì)菌大幾倍到幾十倍,部分處于出芽繁殖過(guò)程中菌體還可觀察到芽體,大多數(shù)菌體上還有芽痕。霉菌:菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線菌粗得多,常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍到幾十倍,在低倍鏡下即可看到,并還可看到孢子囊梗、囊軸、孢子囊、包囊孢子等。四. 玻璃器皿的洗滌、包扎與滅菌1. 高壓蒸

4、汽滅菌開(kāi)始時(shí)為什么要將鍋內(nèi)排盡?滅菌后為什么要待壓力降低到“0”時(shí),才能打開(kāi)排氣閥,開(kāi)蓋取物?因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒羝呐蛎泬?所以,當(dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí),在同一壓力下,含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。如果壓力未降到0時(shí),打開(kāi)排氣閥,就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降,使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡(壓力突然下降而發(fā)生復(fù)沸騰而沖出燒瓶口或試管口,造成培養(yǎng)基等液體沾濕棉塞或溢出等事故。2. 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案,比較干熱滅菌和濕熱滅菌的效果。以下試驗(yàn)方案有關(guān)操作均遵循無(wú)菌操作條件和等量原則。(一實(shí)驗(yàn)材料試管鑷子酒精燈嗜熱脂肪芽孢桿菌ATCC 7053 菌片紙片(與菌片同大小同材料溴甲酚紫蛋白凍水培養(yǎng)基(已

5、滅菌等實(shí)驗(yàn)材料(材料有余。(二對(duì)照組取9支潔凈試管,分為A1 B1 C1 三組(每3支一組,將A1 組中放入菌片,B1 組中放入紙片,C1組中什么也不加;不經(jīng)滅菌,直接加入溴甲酚紫蛋白凍水培養(yǎng)基(等量。(三恒為培養(yǎng)將上述所有試管按分組在56恒溫條件下培養(yǎng)48小時(shí)。3. 為什么干熱滅菌比濕熱滅菌所需溫度高時(shí)間長(zhǎng)?在濕熱條件下,有水蒸汽的作用:a高溫水蒸汽導(dǎo)熱比干空氣要快;b高溫水蒸汽冷凝變水時(shí)有放熱過(guò)程;c高溫水蒸汽能穿透細(xì)菌的細(xì)胞膜,直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)破壞細(xì)胞;c高溫水蒸汽能水解一部分細(xì)胞結(jié)構(gòu),加速導(dǎo)熱。(濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分,蛋白質(zhì)較易凝固,因蛋白質(zhì)含水量增加,所需凝固溫度降低;濕熱的穿透力比

6、干熱大;濕熱的蒸汽有潛熱存在,每1克水在100時(shí),由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出2.26kJ(千焦的熱量。這種潛熱,能迅速提高被滅菌物體的溫度,從而增加滅菌效力。五. 培養(yǎng)基的配置1. 配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,有哪些操作步驟?那幾步易出錯(cuò),如何防止?稱(chēng)取藥品加熱溶化分裝加棉塞包扎滅菌擱置斜面易出錯(cuò)的步驟有:a 稱(chēng)取藥品稱(chēng)取時(shí)鑰匙專(zhuān)用,瓶蓋不要錯(cuò)蓋,易吸水的藥品要快速稱(chēng)取;b 加熱溶化加入藥品后要用玻璃棒不停攪拌,以免糊底(在瓊脂熔化過(guò)程中,應(yīng)控制火力,以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器,同時(shí),需不斷攪拌,以防瓊脂糊底燒焦。;c 分裝分裝時(shí)培養(yǎng)基不能粘在三角瓶(或試管口,以免接種時(shí)染菌;d 擱置斜面斜面長(zhǎng)度約試

7、管長(zhǎng)度一半為宜。2. 配制培養(yǎng)基的一般原則是什么?a 目的明確b 營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)c 理化適宜d 經(jīng)濟(jì)節(jié)約六. 平板菌落計(jì)數(shù)法1. 平板菌落計(jì)數(shù)法的原理是什么? 它適用于那些微生物的計(jì)數(shù)?平板菌落計(jì)數(shù)法是將等測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后,其中的微生物充分分散為單個(gè)細(xì)胞,取一定量的稀釋液接種到平板上,經(jīng)過(guò)培養(yǎng),由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成的肉眼可見(jiàn)的菌落,即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù),根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。(但是,由于待測(cè)樣品往往不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞,所以,長(zhǎng)成的一個(gè)單菌落也可能來(lái)自樣品中的23或更多個(gè)細(xì)胞。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低?，F(xiàn)在常使用菌落形成單位

8、。平板計(jì)數(shù)法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)微生物繁殖而形成的現(xiàn)象進(jìn)行的,也就是一個(gè)菌落可代表一種微生物(并不絕對(duì)。通常用來(lái)測(cè)定樣品中所含細(xì)菌、孢子、酵母菌等單細(xì)胞微生物的數(shù)量。2. 菌落樣液移入培養(yǎng)皿后,若不盡快地倒入培養(yǎng)基并充分搖勻,將會(huì)出現(xiàn)什么結(jié)果?為什么?出現(xiàn)的結(jié)果是:形成菌落過(guò)于集中,不能形成均勻分布的單菌落,導(dǎo)致無(wú)法計(jì)數(shù)。因?yàn)?若不立即搖勻,菌體常會(huì)吸附在皿底上,不易形成均勻分布的單菌落,從而影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。3. 要獲得本次試驗(yàn)的成功,那幾步最為關(guān)鍵?為什么?a 稀釋菌液若在稀釋時(shí)移液管混用可使稀釋梯度不準(zhǔn)確,從而導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差(放菌液時(shí)吸管尖不要碰到液面,即每一

9、支吸管只能接觸一個(gè)稀釋度的菌懸液,否則稀釋不精確,結(jié)果誤差大。;b 稀釋倒平板 1 若再加入菌液不立即倒入培養(yǎng)基,可使菌體黏附于皿底;2 若不注意培養(yǎng)基溫度,溫度過(guò)高會(huì)將菌體燒死,溫度過(guò)低會(huì)使培養(yǎng)基一倒入立即凝固,從而菌體不能均勻分布;3 倒入培養(yǎng)基需立即搖勻,否則菌體常會(huì)吸附在皿底上,不易形成均勻分布的單菌落,從而影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性;4 選擇倒平板的稀釋梯度也是很重要的,一般以三個(gè)連續(xù)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為宜,否則要適當(dāng)增加(或減少稀釋度加以調(diào)整。4.平板菌落計(jì)數(shù)法與顯微鏡直接計(jì)數(shù)法相比有何優(yōu)缺點(diǎn)?平板菌落計(jì)數(shù)法最大的缺點(diǎn)是速度慢,需要平板上長(zhǎng)出菌落一段

10、時(shí)間后才能計(jì)數(shù).但是由于平板菌落計(jì)數(shù)法通常做梯度稀釋,所以計(jì)數(shù)的線性范圍大.由于是菌懸液涂布,所以比較均勻,能較好的反應(yīng)菌落的疏密程度.重復(fù)性,平行性很好,而計(jì)的是活菌數(shù)。是經(jīng)典的計(jì)數(shù)方法.七. 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法1. 為何用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板可計(jì)得樣品總菌值?敘述其適用范圍。a 計(jì)數(shù)室體積一定;b 在顯微鏡下,不經(jīng)染色不能分辨菌體的死活,使計(jì)數(shù)所得的數(shù)目為一定體積內(nèi)的總菌數(shù),從而計(jì)得樣品中總菌值。適用范圍:可單細(xì)胞存在的細(xì)菌酵母菌或顯絲狀生長(zhǎng)的真菌,放線菌所生的孢子等。2. 為什么計(jì)數(shù)室內(nèi)不能有氣泡?試分析產(chǎn)生氣泡的可能原因。a 氣泡會(huì)占據(jù)計(jì)數(shù)室的空間,導(dǎo)致計(jì)數(shù)室中的菌體個(gè)數(shù)計(jì)數(shù)偏小,最后導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)

11、果偏小。b 計(jì)數(shù)室內(nèi)的氣泡,可影響菌液的隨機(jī)分布,使計(jì)數(shù)產(chǎn)生誤差。產(chǎn)生氣泡原因:a 操作不當(dāng),先放菌液再蓋蓋玻片;b 計(jì)數(shù)室洗滌不干凈;c 蓋玻片移動(dòng),造成空氣進(jìn)入而產(chǎn)生氣泡。3.試分析影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差來(lái)源及提出改進(jìn)措施?1、儀器誤差:所用器材均應(yīng)清潔干凈,并且計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)區(qū)不應(yīng)該有擦痕。2、計(jì)數(shù)室內(nèi)可能有氣泡。因?yàn)榻湍讣?xì)胞并沒(méi)有染色,看起來(lái)是透明的,有氣泡很容易被計(jì)入,使數(shù)值偏高;并且,氣泡會(huì)影響菌懸液的隨機(jī)分布。改進(jìn):若產(chǎn)生氣泡,則用吸水紙吸出。3、菌體在計(jì)數(shù)板上分布不均,當(dāng)用選取5格計(jì)數(shù)時(shí),會(huì)造成很大誤差。改進(jìn):應(yīng)使菌液自然流入并混勻,進(jìn)行觀察時(shí)盡可能多數(shù)幾個(gè)格子。4、配制稀釋液時(shí)吸取

12、的濃度過(guò)高或過(guò)低,導(dǎo)致稀釋液濃度和原液不成正確比例,計(jì)算時(shí)產(chǎn)生誤差。應(yīng)將原液搖晃均勻后取中部的液體進(jìn)行稀釋。5、由于數(shù)菌體數(shù)目時(shí)視覺(jué)疲勞而導(dǎo)致的視覺(jué)誤差。應(yīng)多人觀察,取記錄平均數(shù)。6、計(jì)數(shù)時(shí)可能將格四周的菌都計(jì)算在內(nèi)了,使數(shù)值偏高。改進(jìn):謹(jǐn)遵一個(gè)規(guī)則,計(jì)上不計(jì)下,計(jì)左不計(jì)右,不可以重復(fù)計(jì)數(shù)。7、可能出現(xiàn)有出芽的酵母菌,將出芽的酵母菌按兩個(gè)計(jì)數(shù)了,使數(shù)值偏高。改進(jìn):計(jì)數(shù)時(shí),只有當(dāng)芽體于母細(xì)胞一樣大的時(shí)候,才能計(jì)為兩個(gè)。8、微量移液器的最小量程太大,在加樣時(shí),容易加多,使蓋玻片鼓起,血球計(jì)數(shù)板所技術(shù)的體積變大,最終結(jié)果偏大。改進(jìn):用量程的小的微量移液器并少加一些。八. 微生物的純培養(yǎng)技術(shù)1. 如果一項(xiàng)科學(xué)研究?jī)?nèi)容需從自然界中篩選到能產(chǎn)生高溫蛋白酶的菌株,你將如何完成?寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)方案(產(chǎn)蛋白酶菌株在酪素平板上能形成降解酪素透明圈。以下試驗(yàn)方案有關(guān)操作均遵循無(wú)菌操作條件一材料準(zhǔn)備1 土壤【有機(jī)質(zhì)(特別是蛋白質(zhì)含量豐富的土壤】2 滅菌生理鹽水(0.85%NaCl3 滅菌移液管4 添加酪素的B4(牛肉膏蛋白胨完全培養(yǎng)基經(jīng)滅菌5 B4斜面(經(jīng)滅菌6 其他材料:接種環(huán)酒精燈等二操作方法1在盛有10ml滅菌生理鹽水的燒杯中添加1g土壤,配成懸浮液;2 稍靜止后,用滅菌移液管移取部分上清液,將其制成104106倍的稀釋液;3 用滅菌移液管吸取各稀釋液用稀釋倒平板法