高效液相色譜儀維護(hù)規(guī)程

1、1目的建立本實(shí)驗(yàn)室高效液相色譜儀的保養(yǎng)維護(hù)操作，確保儀 器能正常使用。2適用范圍適用于本實(shí)驗(yàn)室高效液相色譜儀的保養(yǎng)維護(hù)操作。3責(zé)任者本實(shí)驗(yàn)室所有操作高效液相色譜儀人員。4操作規(guī)程高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入 裝有填充劑的色譜柱，對供試品進(jìn)行分離測定的色譜方法。 注入的供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離， 并依次進(jìn)入檢測器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色 譜信號(hào)。4.1對儀器的一般要求和色譜條件所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應(yīng)定期檢定并符合有 關(guān)規(guī)定。4. 1. 1色譜柱反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，常用的色譜柱填充劑 為化學(xué)鍵合硅膠，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最

2、為常用，辛基 硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氯基鍵合硅烷 和氨基鍵合硅烷相等）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填 充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統(tǒng)使用離子 交換填充劑；分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球 等填充劑；對映異構(gòu)體的分離通常使用手性填充劑。填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、 鍵合基團(tuán)的表面痕蓋度、含炭量和鍵合類型等）以及色譜柱 的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子 量小于2000的化合物應(yīng)選擇孔徑在15nm （1nm=10A）以下 的填料，分析分子量大于2000的化合物則應(yīng)選擇孔徑在 30nm以上的填料。除另有規(guī)定外，普通分析柱

3、的填充劑粒 徑一般在31 Oum之間。粒徑更小（約2um）的填充劑常用 于填裝微徑柱（內(nèi)徑約2mm）o使用微徑柱時(shí)，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測池體積和系 統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適 當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對其測定結(jié)果產(chǎn)生爭議時(shí)，應(yīng)以品種項(xiàng)下規(guī)定 的色譜條件的測定結(jié)果為準(zhǔn)。以硅膠為載體的鍵合固定相 的使用溫度通常不超過40°C,為改善分離效果可適當(dāng)提高 色譜柱的使用溫度，但不宜超過60°C。流動(dòng)相的PH值應(yīng)控制在2飛的。當(dāng)PH大于8時(shí)，可使載體 硅膠溶解；當(dāng)PH小于2時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水 解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用PH值大于8的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)GAGG

4、AGAGGAFFFFAFAF選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆 蓋度的鍵合硅膠填充劑、包裹聚合物填充劑、有機(jī)-無機(jī)雜 化填充劑或非硅膠基鍵合填充劑等；當(dāng)需使用PH值小于2 的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn) 生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基 硅烷鍵合硅膠填充劑、有機(jī)-無機(jī)雜化填充劑等。4. 1.2檢測器 最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極 管陣列檢測器、其他常見的檢測器有熒光檢測器、示差折光 檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。 紫外、熒光、電化學(xué)檢測器為選擇性檢測器，其響應(yīng)值不僅 與供試品溶液的濃度有關(guān)，還與化合物的結(jié)

5、構(gòu)有關(guān)；示差折 光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器為通用型檢測器，對所有的化 合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散檢測器對結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響 應(yīng)值幾乎僅與供試品的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測器可以同 時(shí)記錄供試品的吸收光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色 譜峰的純度檢查。紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測器的響應(yīng)值與供試品溶 液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測器響 應(yīng)值與供試品溶液的濃度通常呈指數(shù)關(guān)系，故進(jìn)行計(jì)算時(shí)， 一般需經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換。不同的檢測器，對流動(dòng)相的要求不同。 如采用紫外檢測器，所用流動(dòng)相應(yīng)符合紫外一可見分光光度 法（附錄V A）項(xiàng)下對溶劑的要求；采用低波長檢測時(shí)，還 應(yīng)考慮有機(jī)相中有機(jī)溶劑的截

6、止使用波長，并選用色譜級有 機(jī)溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器通常不允許使用含 不揮發(fā)鹽組分的流動(dòng)相。4. 1.3流動(dòng)相 反相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相首選甲醇-水系統(tǒng)（采用紫外末端波長檢測時(shí)，首選乙睛-水系統(tǒng)），如經(jīng)試用 不適合時(shí)，再選用其他溶劑系統(tǒng)。應(yīng)盡可能少用含有緩沖液 的流動(dòng)相，必須使用時(shí)，應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動(dòng)相， 必須使用時(shí)，應(yīng)盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動(dòng)相。由 于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對于十八烷基 硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑 的比例通常應(yīng)不低于5%,否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除

7、固定相種類、流動(dòng)相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、 檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)供試品并達(dá)到系 統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。其中，調(diào)整流動(dòng)相組分比例時(shí)，以組 分比例較低者（小于或等于50%）相對于自身的改變量不超 過±30%且相對于總量的改變量不超過±10%為限，如30%相 對改變量的數(shù)值超過總量的10%時(shí)，則改變量以總量的±10% 為限。對于必須用特定牌號(hào)的填充劑方能滿足分離要求的品種，可 在該品種項(xiàng)下注明。5. 液相色譜儀使用注意事項(xiàng)5. 1.流動(dòng)相必須用HPLC級的試劑，使用前

8、過濾除去其中的 顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)（使用0. 45um或更細(xì)的膜過濾）o5.2. 流動(dòng)相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫 后使用。5.3. 不能用純乙睛作為流動(dòng)相，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致 泵不進(jìn)液。5. 4.使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管 路及柱子一小時(shí)，然 后用甲醇（或甲醇水溶液）沖洗40分鐘 以上，以充分洗去離子。對于柱塞桿外部，做完樣品后也必 須用去離子水沖洗20ml以上。5. 5.長時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注 意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相（如甲醇等），因?yàn)?純水易長霉。5. 6.每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器。5

9、.7. C18柱絕對不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。5.8.堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱T混合器中的過濾器T管路 過濾器T單向閥檢查并清洗。清洗方法；以異丙醇作溶劑 沖洗：放在異丙醇中間用超聲波清洗；用10%稀硝酸清洗。5. 9.氣泡會(huì)致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過程中要 盡量避免產(chǎn)生氣泡。5. 10.如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí)，要使 用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相的清洗。5. 11.要注意柱子的pH值范圍，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品， 特別是堿性樣品。5. 12.更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng) 邊靖洗，然后插入新的流動(dòng)相中。更換無互溶性的流動(dòng)相時(shí) 要用異丙醇過渡一下。5.1

10、3: 一定打開排液閥，再排空，否則很容易把色譜柱沖 塌陷。5. 14如果流動(dòng)相中含有酸，用10%的甲醇（乙睛）水溶液 沖洗系統(tǒng)40"60min,然后再用100%甲醇沖洗系統(tǒng)10min, 保證所有管路都在100%甲醇溶液中。5. 15如果流動(dòng)相中含有離子對或緩沖鹽，用10%的甲醇（乙 睛）水溶液沖洗系統(tǒng)6090min,然后再用100%甲醇沖洗系 統(tǒng)10min,保證所有管路都在100%甲醇溶液中。5. 16如果管路長時(shí)間不用，請用100%甲醇把管路沖洗干凈, 以免管路發(fā)霉、長菌、腐敗。5. 17經(jīng)常將2個(gè)管路相互使用不同的流動(dòng)相。5. 18如果儀器可以連續(xù)使用，不必關(guān)機(jī)，如果超過48h以 上，就可以考慮關(guān)機(jī)，節(jié)約氛燈壽命。6、液相維護(hù)6.1. 管路過濾器的檢查及清洗，吸濾頭及在線過濾器先用 異丙醇超聲515min,然后用甲醇超聲515min,隨后用雙 蒸水超聲515min,再用甲醇清洗超聲515min,安裝。6.2. 液相