關于人鼠嵌合抗體制備的可行性

1、-關于人 - 鼠嵌合抗體制備的可行性一、概述人 -鼠嵌合抗體，即抗體的可變區(qū)來自鼠單克隆抗體，而恒定區(qū)則來自人的抗體。它是通過從雜交瘤細胞分離出功能性可變與I恒定區(qū)基因連接，插入適當表達載體，區(qū)基因，人g轉染宿主細胞表達產嵌合抗體既保留了親本抗體特異性結合抗原又大大減少了生。的能力，鼠源性在人體內的免疫原性，其半衰期明顯延長，且在介導CDC 及 ADCC 方面亦明顯增強。二、市場分析附表是中國SFDA 批準上市和進入臨床的治療型單抗藥物-抗體名稱Muromonab-CD3RituximabTrastuzumabBasiliximabTrastuzumabOKT3抗人 IL-8 單克隆抗體乳膏重

2、組人源化抗人表皮因子受體單克隆抗體注射液碘 131I 美妥昔單抗注射碘 131I 人鼠嵌合型腫瘤細胞核單克隆抗體注射液重組人型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白鼠抗人 T 淋巴細胞 CD3表面抗原單克隆抗體注射用抗腎病綜合癥出血熱病毒單克隆抗體（ I型）抗人肝癌單抗Hepama 1抗乙型腦炎單抗注射用重組人型腫瘤壞死因子受體 -抗體融合廠家靶抗原強生CD-3羅氏CD-20羅氏HER-2諾華CD-25基因泰克HER-2武漢生物制品研CD-3究所東莞宏遠逸士生IL-8物公司百泰生物藥業(yè)人表皮因公子司受體成都華神集團， 第四軍醫(yī)大學上海美恩生物技術公司上海中信國健腫瘤壞死藥因業(yè)公司子濟南天康生物制CD-3

3、品公司武漢生物制品所，第四軍醫(yī)大學中科院細胞所北京生物制品所，第四軍醫(yī)大學上海美恩生物公司抗體類適應癥研發(fā)型階段鼠源抗移植排斥批準上市嵌合B 細胞非霍奇金批準上市淋巴瘤人源化乳腺癌批準上市嵌合抗移植排斥批準上市人源化乳腺癌批準上市鼠源抗移植排斥批準上市鼠源銀屑病批準上市批準人源化上皮源性腫瘤上市批準鼠源肝癌上市嵌合抗腫瘤批準上市人源化銀屑病和 強直性批準上市脊柱炎鼠源抗移植排斥臨床研究臨床鼠源出血熱期鼠源肝癌臨床研究鼠源乙型腦炎臨床研究臨床嵌合腫瘤研究-蛋白-目前國內上市的單抗藥物有11 個，其中5 個是國外進口產品，我國上市的自行開發(fā)的治療性單抗藥物6 個，處于臨床研究階5 個 6) 。其中

4、，武漢生物制品研究所的有段的有(表抗腎移植單OKT3 （注射用鼠源性T 淋巴細CD 抗原單克隆抗體） ，也是最早批準抗抗人胞3上市的國內自行研制的具有免疫抑制作用，可逆轉對移植器官的由北京百抗體，排斥反應；泰生物藥業(yè)有限公司與古巴合作開發(fā)的I 類癌癥治療新藥“重組人源化抗人表皮生長因子受體單克隆抗體”（商品名：泰欣生）于2005 年 4 月 11 日獲得國家I類新藥證書。這是我國批準的第一個人源化單克隆抗體藥物，它的問世標志著我國在癌癥靶向治療和人源化抗體藥物領域取得重大突破，該藥主要用于治療頭頸部、食管、肺部、乳腺、結直腸等部位的上皮源性腫瘤；由第四軍醫(yī)大學、成都華神集團股份有限公司聯(lián)合研制

5、的碘131美妥昔單抗注射液（商品名：利卡?。?2005 年 4 月 20 日獲得國家I類新藥證書。這是全球第一個用于治療原發(fā)性肝癌的藥物，也是我國第一個具有自主知識產權的抗體類藥物。三、應用嵌合抗體目前主要用于藥物治療方面，與鼠抗相比， 嵌合抗體既保留了鼠源可變的高親和性，又具有人Fc 段的多種免疫殺傷功能，從而大大降低了人抗鼠抗體反應的發(fā)生幾率，改善了臨床治療效與其它小分子基因工程抗體嵌合抗體作為完成的抗體在果，相比，分子，體內半壽期更長，并具Fc 段的多種免疫殺傷功能。有人四、技術路線-從雜交瘤細胞中提取總RNA反轉錄合成cDNA擴增輕鏈、重鏈的V 區(qū)基因克隆、測序分析插入含信號肽及人

6、Ig 重鏈、輕鏈 C 區(qū)基因的真核表達載體酶切鑒定、測序分析轉染 Sp2/0 細胞檢測抗體特異性與人源性制備腹水生產抗體五、材料與儀器1 材料大腸桿菌DH5 ，大腸桿菌感受態(tài)細胞，T-A 克隆載體T-Easy Vector，含信號肽及重鏈、輕鏈恒定區(qū)基因的質粒pAc- -CH3 ，分泌單抗的雜交瘤細胞，真核表達載體pcDNA3.1，小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0 。2 主要試劑氨芐西林鈉，限制性內切酶，T4 DNA連接酶，Taq DNA 酶， Trizol RNA 提取試劑盒，反轉錄PCR 試劑盒，瓊脂糖，嗅化乙錠(EB) ，dNTPs，DNA Marker，DNA凝膠回收試劑盒，質粒抽提試劑盒，胎

7、牛血清，無血清培養(yǎng)液，二甲亞砜(DMSO) ，轉染試劑盒 LipofectamineTM2000 ， MTX ，抗原，羊抗人IgG Fc 片段 -HRP 酶標抗體。3 主要儀器低溫高速臺式離心機，恒溫搖床，恒溫水浴箱，水平式電泳儀，PCR 擴增儀，紫-外分光光度計，紫外透射儀，CO 2 培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，潔凈工作臺，酶標儀。六、關鍵技術與方法1 可變區(qū)基因克隆1.1RNA 提取及反轉錄取對數(shù)生長期的雜交瘤細胞株約10 7 個細胞，按照 Trizol RNA 提取試劑盒的說明書抽提細胞的總RNA ，再進行RT-PCR 擴增，回收純化擴增產物備用。1.2擴增輕鏈、重鏈的V 區(qū)基因根據 Orlan

8、di等（ 1989 ）設計的擴增小鼠可變區(qū)基因的引物，以上述擴增產物為模板擴增抗體基因的可變區(qū)?；豓H360 bp ）、 VL330 bp ）片段，插收重鏈（約輕鏈（約入 T-載體，各3 份樣品測序。測序所得GeneB核酸數(shù)據庫中進行分easy送序列在ank類及同源性分析。兩端加入酶切位點根據上述PCR 產物序列設計含酶切位點的引物，再次進行擴增，以使抗體可變區(qū)基因片段具有與載體相吻合的酶切位點，便于插入表達載體?；厥占兓瘮U增產物備用。2 嵌合抗體表達載體構建改造含信號肽及人Ig 重鏈和輕鏈 C 區(qū)基因片段的單克隆位點設計含重鏈信號肽起始位點序列及酶Nhe 的上游HLF，切位點引物（ KOZA

9、K+4G即 GCCGCC ATG G），位點的下游HLR ，以質pAc-為模板，和含Xh引物粒CH3o擴增出重鏈信號肽基因片段；Xh Kp位點上游HCF ，和 Furin設計含o和n引物含（ RKRR ）序列及酶切Xb的下游引HCR ，以pAc-為模板，擴增位點a物質粒CH3出重鏈恒定區(qū)基因片段片Xh 連接上述片段得到含重鏈信MC 及重鏈段；用o號肽、S恒定區(qū)的基因片段。設計含酶切Apa的上游LLF ，和EcoR 位點的下游LLR ，以質位點引物含引物粒 pAc- -為模板，擴增出輕鏈信號肽基因片段；EcoR Hin 位點上CH3設計含和d游引LCF ，和 Pme 的下游LCR ，以pAc-

10、為模板，擴增出輕鏈恒物含引物質粒CH3-定區(qū)基因片段片段；EcoR 連接上述片段得到含輕鏈信MC 及輕鏈恒定區(qū)的用號肽、S基因片段。構建含信號肽及人Ig 重鏈和輕鏈 C 區(qū)基因片段表達空載體用合成的含酶切位點（Xba 和 Apa ）的 2A 序列連接上述重、輕鏈，得到含信-號肽及人Ig 重鏈和輕鏈C 區(qū)基因的基因片段LigC （Leader + IgConstant）。然后與Nhe和 Pme 雙酶切過的pcDNA3.1-CA大片段連接，即得到嵌合抗體真核雙表達載體pcDNA3.1-CA（ chimeric antibody, CA）。pcDNA3.1圖譜插入含鼠源Ig 重鏈和輕鏈V 區(qū)基因雙酶

11、切表達載體pcDNA3.1-CA和純化的VL ，經瓊脂糖凝膠電泳分離純化目的片段后 ,連接、轉化大腸桿菌，篩選出pcDNA3.1-CA-VL陽性克隆，富集培養(yǎng)后提取質粒進行酶切鑒定。然后， 雙酶切表達載體pcDNA3.1-CA-VL和純化的VH ，分離純化相應的酶切片段，重復上述步驟，構建成重組表達載體pcDNA3.1-CA-XX （抗原單詞的首字母）。3 轉染 Sp2/0 細胞-接種適量 Sp2/0 細胞于培養(yǎng)瓶中， 培養(yǎng) 12 h 后用純化的載體 pcDNA3.1-CA-XX DNA,采用 Lipofectamine 2000 試劑轉染，按試劑盒使用說明書進行。設置空載體和無載體的-細胞為

12、對照。 轉染 72 h 后，加含 MTX 的選擇性培養(yǎng)基進行篩選。2 周后將生長出的陽性克隆利用有限稀釋法單克隆化。4 陽性克隆鑒定與篩選以間接法用抗原和酶標羊抗人IgG Fc 片段抗體檢測嵌合抗體的特異性及重組性。以適量抗原包被酶標板，加細胞培養(yǎng)上清反應后，再加羊抗人IgG Fc 片段 -HRP 酶標抗體（經鼠Ig 吸附過）孵育，顯色后測A490 吸光值。5 抗體腹水生產腹腔種植轉染瘤細胞，57 天后抽取腹水。一只種植雜交瘤細胞的小鼠有時可產生多達 10ml 的腹水。報道稱從腹水中獲得的嵌合抗體產量可達12 mg/ml。七、時間及成本預算表 1時間預算項目時間（周）載體構建（外包，一次性）8雜交瘤細胞培養(yǎng)0.5RNA 提取與反轉錄0.5引物合成1V 區(qū)基因擴增與克隆2V 區(qū)基因測序1插入表達載體及鑒定2表達載體擴增與抽提1轉染 Sp2/0 細胞與篩選3嵌合抗體檢測與篩選1總計（ First Time ）20表 2 成本預算項目費用（元）感受態(tài)細胞-T-Easy Vector載體構建（外包）T4