體外循環(huán)前后不同組織細胞因子的差異表達

1、    作者：齊弘煒，吳明營，韓欣剛，陳楠，張吉濤，趙鳳華，孫婷婷，朱朗標 【摘要】  目的 應用基因芯片技術探討外周血單個核細胞(PBMC)及心房組織細胞因子的差異表達基因，探討不同組織對體外循環(huán)(CPB)的反應。方法 CPB開始、CPB結(jié)束即刻抽取患者動脈血，密度梯度離心法分離PBMC;取CPB開始及CPB結(jié)束即刻的右房組織。用BD AtlasTM cDNA Expression Arrays表達譜基因芯片對比CPB前及CPB后二者間細胞因子的差異表達。結(jié)果 CPB前PBMC及心房間細胞因子基因表達差異明顯者有IL-6、IL-13

2、、Wnt5a、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素型受體、卵泡刺激素受體和盤狀結(jié)構(gòu)域受體2。CPB后二者的基因表達譜均發(fā)生變化，差異明顯者變?yōu)镮L-6、IL-13、-干擾素誘導蛋白(IFI616)、鈣結(jié)合蛋白S100A9(鈣顆粒素B)、胎盤生長因子和Wnt5a。結(jié)論 CPB前PBMC與心房組織的細胞因子基因表達譜不同，CPB刺激后基因表達譜發(fā)生變化，但變化不一致，使差異表達基因發(fā)生變化。 【關鍵詞】  細胞因子;基因表達;基因芯片;外周血單個核細胞;心肌;體外循環(huán)Abstract: OBJECTIVE To determine the differentially expressed

3、genes of cytokines between peripheral blood mononuclear cell (PBMC) and right atrium using gene chip technique. To explore the reactions to cardiopulmonary bypass(CPB) in the different tissues.METHODS The patients' oxygenated bloods were drawn immediately before onset and termination of CPB. PBM

4、C were obtained from heparinised blood by Ficoll gradient centrifugation. Right atrium were collected just before onset and termination of CPB. The differential expression between PBMC and atrium was compared using BD AtlasTM cDNA Expression Arrays. RESULTS Between PBMC and right atrium before CPB,

5、the differentially expressed genes were interleukin 6, interleukin 13, Wnt5a, corticotropin releasing hormone receptor 1 (CRH1R), follicle stimulating hormone receptor (FSH-R) and discoidin domain receptor family, member 2 (discoidin domain receptor, DDR2). Both of the gene expression profiles chang

6、ed after CPB. The differentially expressed genes between PBMC and right atrium were interleukin 6, interleukin 13, interferon alpha-inducible protein (clone IFI-6-16), S100 calcium binding protein A9 (calgranulin B), placental growth factor and Wnt5a. CONCLUSION The gene expression profiles in cytok

7、ines of PBMC and right atrium were different before CPB. The gene expression profiles changed in different manners after CPB. So, the differentially expressed genes changed.Key words： Cytokine; Gene expression; Gene chip; Peripheral blood mononuclear cell; Myocardium; Cardiopulmonary bypass體外循環(huán)(card

8、iopulmonary bypass,CPB)手術中的創(chuàng)傷、低溫、缺血-再灌注及血液與異物的接觸觸發(fā)了全身系統(tǒng)性炎癥反應，其中細胞因子起傳遞介質(zhì)的作用。生理狀況下，同一種基因在不同的組織中表達量不同，對CPB反應也不相同1-2;病理狀態(tài)下，CPB后基因表達譜也不相同3。即使同一種細胞，來自于同一個體不同的生活環(huán)境，其基因表達也不同4。外周血單個核細胞(PBMC)是主要的細胞性炎性反應成分，也是體液性炎性因子的來源之一，但不是主要來源5。CPB中基因芯片技術的方法應用較少，PBMC與心肌組織基因表達譜的差異尚未見報道，對CPB反應的差異也未見文獻報道，對其研究可能有助于詳細闡述CPB對細胞因子產(chǎn)

9、生的影響。1 資料與方法1.1 一般資料 選擇1例心臟瓣膜置換的女性患者作為基因芯片標本來源：30歲，49 kg，心功能級(NYHA)，左心室射血分數(shù)(LVEF)55%，CPB時間68 min，主動脈阻斷時間(ACC)26 min，最低鼻咽溫/肛溫27/30.4，心肌保護采用41含血心臟停搏液。試驗符合醫(yī)學倫理學準則并得到醫(yī)院批準，得到患者的知情同意。1.2 方法 CPB開始前及CPB結(jié)束即刻抽取10 ml氧合動脈血，沿管壁緩慢加于淋巴細胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)之上，使界面保持清楚。4、500×g離心20 min。小心吸取上層血漿和中間分離液層之間的白色云霧層得到PBM

10、C，分別加入2個Eppendorf管中，4，400×g離心10 min。丟棄上清液，留取細胞。在每管中各加入0.5 ml TRIzol Reagent(Molecular Research Center, Inc, USA)，吹打使細胞團完全溶解，吸至同一管內(nèi)，-70-80低溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ｉ鲃用}插管、上下腔靜脈插管后，CPB開始前及CPB結(jié)束即刻取右房組織，約半粒黃豆大小，迅速放入凍存管內(nèi)，液氮凍存?zhèn)溆谩?.3 芯片雜交方法及結(jié)果分析 將凍存的PBMC和TRIzol Reagent混合物取出，室溫融化。取凍存的心房組織約100 mg研碎，加入1 ml TRIzol Reagent

11、，吸入1.5 ml的Eppendorf管室溫放置5min。用TRIzol Reagent一步法提取標本總RNA，RNA純度大于1.8，RNA電泳，紫外燈下清晰可見18 s、28 s RNA帶。上述RNA產(chǎn)物分別按BD AtlasTM cDNA Expression Arrays(7744-1，BD Biosciences Clontech,USA)說明書進行以下實驗操作：用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA探針，柱層析法分離cDNA探針(14 000 rpm離心)。將cDNA芯片放進自封袋，然后放入雜交瓶，68下持續(xù)轉(zhuǎn)動預雜交30 min，加入含有32P的cDNA探針，使兩種溶液混勻，排氣后封口。c

12、DNA探針與BD AtlasTM Array于68下持續(xù)轉(zhuǎn)動雜交24 h。68下沖洗液充分漂洗cDNA探針芯片。用鑷子夾取芯片，甩去多余的沖洗液，快速將芯片放入保鮮膜中，將保鮮膜包裝的芯片于磷屏顯像系統(tǒng)顯像過夜。應用Molecular Dynamics系統(tǒng)(STORM 820, USA)掃描磷屏，應用AtlasImage 1.01a軟件對掃描結(jié)果進行分析處理，對照BD AtlasTM Gene Lists Version 5.0總結(jié)分析。芯片結(jié)果比值在2倍以上或Undefined、且差值大于20者為表達有差異。2 結(jié) 果CPB前PBMC及右房組織細胞因子基因表達譜不同，差異明顯者有IL-6、I

13、L-13、Wnt5a、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素型受體(CRH1R)、卵泡刺激素受體(FSH-R)和盤狀結(jié)構(gòu)域受體2(DDR2)，見表1和圖1(見封三)。CPB后二者表達譜均發(fā)生變化，差異明顯者變?yōu)镮L-6、IL-13、-干擾素誘導蛋白(IFI616)、鈣結(jié)合蛋白S100A9(鈣顆粒素B)、胎盤生長因子(PlGF)和Wnt5a，見表2和圖2(見封三)。表1 CPB前PBMC與心房組織細胞因子差異表達基因表2 CPB后PBMC與心房組織細胞因子差異表達基因3 討 論生物學已經(jīng)進入了基因組時代，隨著人類基因組測序工作的完成，不少科學家認為基因組研究應進入一個內(nèi)涵更豐富、更深刻的階段，獲得基因的功能表

14、達譜是這一階段的核心，從物理學的角度講，是將人類基因組上的靜的基因圖譜向時、空展開。確定生物體不同生命過程中基因的表達譜對闡明基因的作用有重要意義?；蛐酒夹g作為一種平行、大通量、同時檢測生理或病理情況下基因表達的工具，在基礎醫(yī)學及臨床應用基礎研究中應用廣泛，但在CPB病理生理相關研究中尚不多見1，3，5-6。此實驗設計應用細胞因子表達譜基因芯片篩選CPB手術前后的不同組織差異表達基因，觀察其對CPB的反應，以更全面地了解CPB對機體的影響，為將來可能的干預提供理論依據(jù)并指明方向。CPB引起的全身性炎癥反應過程伴隨著細胞因子的變化，嚴重者導致全身炎癥反應綜合征，影響術后轉(zhuǎn)歸。以往，一般認為釋

15、放細胞因子是單核細胞、巨噬細胞及血管內(nèi)皮細胞等對補體激活和缺血-再灌注損傷的一種反應。而Tomic等5應用基因芯片和多蛋白分析研究了體外循環(huán)冠狀動脈旁路移植術和非體外循環(huán)冠狀動脈旁路移植術患者的炎性反應、白細胞轉(zhuǎn)錄譜發(fā)現(xiàn)，4868條基因中有45條在CPB開始后發(fā)生明顯變化，血漿蛋白質(zhì)表達譜也發(fā)生變化，但循環(huán)中的白細胞不是造成蛋白質(zhì)表達譜變化的主要原因。CPB后循環(huán)中的白細胞對黏附因子和信號因子的表達增強，可能使其容易在肺內(nèi)聚集，從而促進后續(xù)的組織炎性反應。相關實驗中6-7我們對比了相同組織CPB前后對細胞因子的表達。我們發(fā)現(xiàn)CPB后心房組織細胞因子基因表達增強，蛋白合成增加，且血液中檢測到其相

16、應蛋白水平升高，但心房組織蛋白表達與其血漿濃度無明顯相關性，說明CPB后可能有多種組織及器官產(chǎn)生細胞因子。另外，同樣是白細胞，同一時間在不同的人體環(huán)境中其基因表達也不同。Kotani等4發(fā)現(xiàn)CPB中來自于肺內(nèi)的白細胞促炎細胞因子(包括IL-6、IL-8和TNF-)的表達強于外周血白細胞的表達。錢玲梅等8用基因芯片對心肌組織進行了研究，包括CPB前及CPB前后的對比研究。實驗發(fā)現(xiàn)，同正常人的右房組織相比，CPB前房間隔缺損患者差異表達基因總結(jié)為發(fā)育、代謝、分化、信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細胞骨架、細胞周期等不同層次、不同功能的基因群。Ruel等1發(fā)現(xiàn)CPB后(閾值P=0.25)心肌上調(diào)基因480條，下

17、調(diào)626條，骨骼肌上調(diào)560條，下調(diào)348條。且骨骼肌及心肌的差異表達基因存在差別，骨骼肌上調(diào)基因包括IL-6、IL-8，是否意味著全身的肌肉組織在CPB手術中都會產(chǎn)生這些細胞因子呢?Ramlawi等2應用類似的方法發(fā)現(xiàn)CPB后右心房組織凋亡介質(zhì)基因表達無明顯變化，但凋亡信號c-Fos和c-Jun基因表達明顯上調(diào)。而骨骼肌均無明顯變化，認為這種基因表達的上調(diào)可能源于缺血-再灌注損傷。我們分析實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPB前PBMC和心房之間的差異表達基因主要歸類為炎性因子和信號轉(zhuǎn)導。CPB后6條差異表達基因中有3條發(fā)生變化，IL-6、IL-13和Wnt5a仍存在差異，新增差異表達基因為IFI616、鈣結(jié)

18、合蛋白S100A9和PlGF。干擾素誘導蛋白IFI616屬于跨膜蛋白，與轉(zhuǎn)錄功能有關。鈣結(jié)合蛋白S100A9也稱為轉(zhuǎn)移抑制因子相關蛋白14(MRP14)，它和MRP8構(gòu)成異二聚體叫鈣網(wǎng)蛋白，是一種鈣鋅離子結(jié)合蛋白復合物，血管壁上各種細胞來源的巨噬細胞都能表達此蛋白，或者說中性粒細胞和單核細胞/巨噬細胞分泌S100A8/A9異二聚體，鈣網(wǎng)蛋白能去除靶細胞內(nèi)的鋅離子而誘導其凋亡9;S100A9和S100A8/A9誘導單核細胞和巨噬細胞分泌促炎性細胞因子10。此實驗中，CPB后心房組織鈣結(jié)合蛋白S100A9表達強度低于PBMC，說明CPB后PBMC的鈣結(jié)合蛋白S100A9基因表達強于心房組織，作為功

19、能執(zhí)行者的蛋白表達是否增強，尚不明了。PlGF具有多種功能，與發(fā)育、分化、內(nèi)皮生長及血管生成等有關。在進一步的實驗中我們發(fā)現(xiàn)，CPB后心肌PlGF基因表達增強，其心肌及血漿蛋白濃度均升高7。文獻報道IL-6在CPB中已有升高，CPB結(jié)束時處于較高水平，CPB后3 h左右達高峰，24 h后接近術前水平。實驗結(jié)果顯示CPB前及CPB后PBMC及心肌的IL-6表達均不同，心肌表達強度低于PBMC。IL-13是一種抗炎性細胞因子，同PBMC相比，心肌IL-13基因表達由CPB前的低表達變?yōu)楸磉_增強。文獻報道，CPB手術前后血漿IL-13濃度無明顯變化，抗炎性細胞因子的低表達可能和術后并發(fā)癥發(fā)生有關11

20、-12。IL-13基因表達增強和血漿IL-13濃度無明顯相關，符合細胞中mRNA的豐度和蛋白合成不成正比的觀點。Wnt信號傳導途徑是調(diào)控細胞生長增殖的關鍵途徑，其進化非常保守。IL-6可以誘導Wnt5a上調(diào)，Wnt5a激活Wnt途徑。單純肥胖患者特殊的心臟轉(zhuǎn)錄譜包含了Wnt信號傳導途徑13，房缺患者Wnt信號途徑發(fā)育不良8。由于早期設備及技術尚不完善，這個時期基因芯片的結(jié)果不是很可靠，需要通過其他技術驗證。且芯片僅為篩查，費用較高，實驗用1例患者的資料反應CPB前后細胞因子基因的差異表達有一定局限性，但證明了這種新技術、新方法在心外科科研方面的應用價值。個體間的基因存在一定差異，對CPB的反應

21、也不盡相同，1例標本反應了其共性，而不能代表所有個體。而第二代功能分類基因芯片達到了實時定量PCR的水平，不再需要PCR驗證。此實驗設計用1對芯片篩選了CPB前后不同組織間細胞因子的基因表達(橫向比較)和縱向比較(同種組織CPB前后的比較)時6芯片原始資料均相同，結(jié)果可靠，故未進行RT-PCR驗證。如果有驗證步驟及結(jié)果，會更有說服力?？傊?，術前身體各組織本身對各種細胞因子的基因表達不同，在CPB應激情況下其反應也不同，產(chǎn)生細胞因子(蛋白質(zhì))的量可能也有差別?！緟⒖嘉墨I】  1 Ruel M, Bianchi C, Khan TA, et al. Gene expressio

22、n profile after cardiopulmonary bypass and cardioplegic arrest J. J Thorac Cardiovasc Surg, 2003,126(5):1521-1530.2 Ramlawi B, Feng J, Mieno S,et al. Indices of apoptosis activation after blood cardioplegia and cardiopulmonary bypass J. Circulation, 2006,114(1 Suppl):1257-1263.3 Voisine P, Ruel M, K

23、han TA, et al. Differences in gene expression profiles of diabetic and nondiabetic patients undergoing cardiopulmonary bypass and cardioplegic arrest J. Circulation, 2004,110 (11 Suppl 1):II280-286.4 Kotani N, Hashimoto H, Sessler DI, et al. Cardiopulmonary bypass produces greater pulmonary than sys

24、temic proinflammatory cytokines J. Anesth Analg, 2000,90(5):1039-1045.5 Tomic V, Russwurm S, Moller E, et al. Transcriptomic and proteomic patterns of systemic inflammation in on-pump and off-pump coronary artery bypass grafting J. Circulation, 2005,112(19):2912-2920.6 齊弘煒，朱朗標，吳明營,等.體外循環(huán)前后外周血單個核細胞細胞

25、因子的差異表達 J.中國胸心血管外科臨床雜志，2008，15(5)：374-378.7 齊弘煒，朱朗標，吳明營,等.表達譜基因芯片篩選體外循環(huán)前后心肌細胞因子的變化 J.中華胸心血管外科雜志，2009，25(3)：181-183.8 錢玲梅，曹克將，黃元鑄,等.房間隔缺損患者心肌組織基因表達譜系特征的初步分析 J.中華心血管病雜志，2003，31(3)：180-183.9 Yui S, Nakatani Y, Hunter MJ, et al. Implication of extracellular zinc exclusion by recombinant human calprotectin (MRP8 and MRP14) from target cells in its apoptosis-inducing activity J. Mediator Inflamm, 2002,11(3):165-172.10 Sunahori K, Yamamura M, Yamana J, et al. The S100A8/A9 het