microRNA91慢病毒載體構(gòu)建及對(duì)小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘…

1、MicroRNA-9-1慢病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的影響*景黎君，賈永林，魯晶晶，韓 瑞，王舒陽，李盡義，彭 濤，賈延劼（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052）摘 要 目的：探討microRNA-9-1在體外誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）向神經(jīng)細(xì)胞分化中的作用。方法: 構(gòu)建小鼠microRNA-9-1慢病毒載體（microRNA-9-1-LV）并感染小鼠MSCs，篩選最適感染復(fù)數(shù)（MOI）；實(shí)驗(yàn)分為未感染組、感染組（感染microRNA-9-1-LV組）、陰性對(duì)照組（感染FU-RNAi-NC-LV）；采用-巰基乙醇誘導(dǎo)感染后小鼠MSCs分

2、化為神經(jīng)細(xì)胞。倒置熒光顯微鏡下觀察MSCs感染后熒光表達(dá)情況；采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)神經(jīng)元烯醇化酶（NSE）、神經(jīng)微管結(jié)合蛋白（MAP-2）和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)變化；PT-PCR檢測(cè)MAP-2 mRNA的表達(dá)變化；MTT方法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果：(1) 陽性克隆PCR證明小鼠microRNA-9-1慢病毒載體構(gòu)建成功，孔稀釋法測(cè)定病毒滴度為1×1012 TU/L。(2) 倒置顯微鏡下觀察小鼠microRNA-9-1慢病毒載體感染成功，MOI值為20，感染4 d時(shí)感染率最高，細(xì)胞存活率較高，感染率可達(dá)91.3% ± 4.2%。(3) -巰基乙醇可以誘導(dǎo)MSC

3、s向神經(jīng)細(xì)胞分化，其中以感染組誘導(dǎo)效果最佳，NSE和MAP-2的表達(dá)率顯著高于其它各組（P<0.05）。結(jié)論：(1) microRNA-9-1可高效感染小鼠MSCs。(2) 感染miRNA-9-1-LV后MSCs經(jīng)-巰基乙醇誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞分化比率增加。關(guān)鍵詞 MicroRNA-9-1；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；神經(jīng)元；慢病毒中圖分類號(hào) R329.21 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A *基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 30770758）；河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2008A320032）通訊作者 Tel: E-mail: jiayanjie1971Effe

4、ct of lentiviral vector of microRNA-9-1 on differentiation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells into neuronsJING Li-jun, JIA Yong-lin, LU Jing-jing, HAN Rui, WANG Shu-yang, LI Jin-yi, PENG Tao, JIA Yan-jie(Department of Neurology, The First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou

5、 450052, China. E-mail: jiayanjie1971)ABSTRACT AIM: To investigate the role of microRNA-9 in inducing bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) to differentiate into neurons. METHODS: The lentiviral vector of microRNA-9-1 (microRNA-9-1-LV) was constructed and transfected into mouse MSCs. The cells w

6、ere divided into non-transfected group, transfected group (transfected with microRNA-9-1-LV) and negative control group (transfected with FU-RNAi-NC-LV). MSCs were treated with -mercaptoethanol (-ME) as an inducer for triggering the cells to differentiate into neurons. The fluorescence expressed by

7、transfected MSCs were observed under inverted fluorescence microscope. The mRNA expression of microtubulin-associated protein 2 (MAP-2) was detected by RT-PCR. The expression of neural cell specific markers, neuron-specific enolase (NSE), MAP-2 and glial fibrillary acidic protein (GFAP), were measur

8、ed by immunocytochemical method. The viability of MSCs was determined by MTT method. RESULTS: The results of PCR confirmed successful construction of mouse microRNA-9-1-LV. The virus titer was 1×1012 TU/L (TU, transduction unit). The best transfection efficiency (up to 91.3% ± 4.2%) and su

9、rvival rate appeared when multiply of infection (MOI) was 20 and on the 4th day. -ME induced MSCs to differentiate into neurons and the best efficiency of the induction was observed in transfected group. The expression levels of NSE and MAP-2 in transfected cells were higher than those in the cells

10、of other groups (P<0.05). CONCLUSION: MicroRNA-9-1-LV has high transfection efficiency in mouse MSCs. Higher differentiation rate from mouse MSCs to neurons is induced by -ME after the cells are transfected with microRNA-9-1-LV.KEY WORDS MicroRNA-9-1; Marrow mesenchymal stem cells; Neurons; Lenti

11、virusmicroRNA是生物體內(nèi)源的小RNA分子，可以在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、表觀遺傳學(xué)水平等水平調(diào)控基因組的表達(dá)，參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程1。誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（marrow mesenchymal stem cells, MSCs）分化為神經(jīng)細(xì)胞有可能成為臨床中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的可行性方法2，但其具體機(jī)制尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞過程中，microRNA在其中起著重要調(diào)控作用3。MicroRNA-9在腦組織中表達(dá)較為豐富，研究表明，microRNA-9在神經(jīng)干或前體細(xì)胞分化發(fā)育中起著重要作用4。MSCs可以向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，但是microRNA-9是否在MSCs

12、誘導(dǎo)分化中起作用尚不清楚。本研究根據(jù)確定的miRNA-9-1序列，構(gòu)建目的microRNA慢病毒載體，將其感染小鼠MSCs，-巰基乙醇誘導(dǎo)各組細(xì)胞，觀察microRNA-9在小鼠MSCs橫向分化為神經(jīng)細(xì)胞中的作用。材料和方法1 動(dòng)物SPF級(jí)BALB/c小鼠，雌雄不限，6 - 8周齡，18 - 20 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(豫)2005-0001。MSCs由大鼠股骨中分離提取，連續(xù)傳10代以上。293T細(xì)胞和大腸桿菌菌株DH5由鄭州大學(xué)生物化學(xué)教研室惠贈(zèng)。2 主要試劑Xba I、Hpa I及T4 DNA連接酶購自NEB；RNA干擾載體pFU-GW-RNAi和病毒包裝三質(zhì)

13、粒：pGC-LV 重組載體（同時(shí)可表達(dá)綠色熒光蛋白）、pHelper 1.0和pHelper 2.0均購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司；感染試劑Lipofectamine 2000 購自Invitrogen；DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；神經(jīng)元烯醇化酶（neuron-specific enolase, NSE H-300，sc-15343）、神經(jīng)微管結(jié)合蛋白（microtubulin-associated protein 2, MAP-2, sc-20172）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP H-50, sc-9065）兔

14、抗多克隆抗體購自Santa Cruz公司；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）購自上海碧云天公司；RNeasy Mini試劑盒、OneStep RT-PCR試劑盒均為Qiagen產(chǎn)品；凝聚胺、多聚賴氨酸和噻唑藍(lán)（MTT）購自Sigma；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見表1。3 主要方法3.1 MicroRNA-9-1慢病毒載體的構(gòu)建 根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫獲得microRNA-9-1 (MI0000720)的序列，設(shè)計(jì)合適的引物序列，PCR方法合成含雙鏈DNA oligo，其兩端含酶切位點(diǎn)黏端。將pFU-GW-RNAi載體Xba I和Hp

15、a I雙酶切后，在T4 DNA連接酶作用下，與雙鏈DNA oligo于4 °C 12 h連接反應(yīng)制備克隆連接液，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行陽性克隆PCR鑒定。脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)感染方法進(jìn)行慢病毒顆粒的包裝。感染前24 h，調(diào)整細(xì)胞293T細(xì)胞密度為6×108 cells/L，重新接種于15 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)70% - 80%時(shí)即可感染。DNA溶液（pGC-LV載體20 g，pHelper 1.0載體15 g，pHelper 2.0載體10 g），與相應(yīng)體積的Opti-MEM混合均勻，調(diào)整總體積為2.5 mL，加入

16、離心管中，室溫下溫育5 min。取100 L Lipofectamine 2000試劑在另一離心管中與2.4 mL Opti-MEM混合，室溫下溫育5 min。然后將分別含有DNA和脂質(zhì)體溶液混合，輕柔混勻，室溫下溫育20 min。將DNA與Lipofectamine 2000 混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37 °C、 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8 h后倒去含有感染混合物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入20 mL的PBS液，輕輕左右晃動(dòng)培養(yǎng)瓶以洗滌殘余的感染混合物，然后倒去。每瓶細(xì)胞中加入含10% 血清的細(xì)胞培養(yǎng)基25 mL，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)

17、培養(yǎng)48 h。收集感染后48 h的293T細(xì)胞上清液，于4 °C、4 000×g離心10 min，除去細(xì)胞碎片。0.45 m濾器過濾上清液于40 mL 超速離心管中，再離心濃縮病毒液至所需濃度。收集病毒液，分裝后-80 °C長(zhǎng)期保存。取其中1支用孔稀釋法進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。同樣方法制備僅含GFP報(bào)告基因的陰性對(duì)照慢病毒載體。3.2 感染復(fù)數(shù)（multiply of infection, MOI）值測(cè)定 取培養(yǎng)10代以上的小鼠MSCs，以2×109 cells/L的密度接種至24孔板，培養(yǎng)2 d至細(xì)胞融合度達(dá)到30% - 50%。分為5個(gè)不同梯度的MOI值。

18、在完全培養(yǎng)基中加入含有microRNA-9-1和GFP（綠色熒光報(bào)告基因）的慢病毒載體上清，對(duì)照組B組加入僅含GFP的陰性對(duì)照慢病毒載體上清，兩組均加上終濃度為5 mg/L的凝聚胺（polybrene）。共感染24 h，換新鮮培養(yǎng)基。感染后每天倒置熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞GFP表達(dá)情況，并計(jì)數(shù)GFP陽性細(xì)胞的百分比。3.3 小鼠MSCs感染及實(shí)驗(yàn)分組 取microRNA-9-1-LV以最適MOI值感染小鼠MSCs，同時(shí)，取同一MOI值的FU-RNAi-NC-LV感染陰性對(duì)照組置于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，孵育24 - 72 h。根據(jù)感染情況將同時(shí)間點(diǎn)的MSCs細(xì)胞分為3組

19、：未感染組：不進(jìn)行感染，其它培養(yǎng)條件同各感染組；感染組：感染microRNA-9-1-LV，即含有microRNA-9-1病毒和GFP；陰性對(duì)照組：感染FU-RNAi-NC-LV，即只含有GFP。在倒置熒光顯微鏡下觀察感染后24 h、48 h、72 h、96 h觀察GFP熒光表達(dá)情況，評(píng)價(jià)細(xì)胞感染效率。3.4 體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞 取各組細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。去除DMEM完全培養(yǎng)基，D-Hanks液清洗3次，加入預(yù)誘導(dǎo)液（DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1 mmol/L -巰基乙醇)置于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。預(yù)誘導(dǎo)后，加入誘導(dǎo)液（DMEM培養(yǎng)基，5 mmo

20、l/L -巰基乙醇），37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)5 h。3.5 MTT比色法 將感染microRNA-9-1-LV和FU-RNAi-NC-LV前后各時(shí)間點(diǎn)的MSC移入96孔培養(yǎng)板，加入MTT（5.0 g/L）50 µL/well、置入培養(yǎng)箱孵育4 h，離心棄上清，加入二甲基亞砜200 µL，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光值，評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率。3.6 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法 將各組細(xì)胞用PBS清洗之后，迅速經(jīng)4%多聚甲醛的固定液中于 4 °C固定過夜，0.2% Triton X-100處理10 min，并用封閉液封閉1 h。然后分別用NSE抗體（1.0

21、mg/L）、MAP-2抗體（1.0 mg/L）和GFAP抗體（1.0 mg/L）4 °C孵育24 h。用PBS 洗3遍后，用Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG（1500）在室溫下進(jìn)行染色標(biāo)記、觀察。細(xì)胞圖像通過顯微鏡用 ×10或 ×20攝取。每組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)都會(huì)采集超過30個(gè)區(qū)域的細(xì)胞。而且，在明視野下所采集的每幅圖像都盡量包含相同的細(xì)胞數(shù)目。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件分析各實(shí)驗(yàn)組的熒光圖片單個(gè)細(xì)胞的累積吸光度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3.7 RT-PCR 采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細(xì)胞的總RNA，分光光度法測(cè)定計(jì)算提取的總RNA含量

22、及濃度。參照OneStep RT-PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說明進(jìn)行RT-PCR，總反應(yīng)體積50.0 L，其中5× OneStep RT-PCR buffer 10.0 L，dNTP Mix 2.0 L，OneStep RT-PCR Enzyme Mix 2.0 L，5× Q-Solution 10.0 L， RNase inhibitor 10 U， RNA 1.0 g，引物 0.6 mol/L。擴(kuò)增條件為：50 °C逆轉(zhuǎn)錄30 min，95 °C初始化15 min，94 °C變性1 min，55 °C 1 min，72 °C

23、1 min，30 - 35個(gè)循環(huán)，72 °C 10 min。然后，取RT-PCR產(chǎn)物10.0 L，加上樣緩沖液2.0 L，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，凝膠圖像分析系統(tǒng)（GelPro Analyzer 3.0）分析各目的基因與-actin基因條帶吸光度值。4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。結(jié) 果1 MicroRNA-9-1慢病毒載體的構(gòu)建pFU-GW-RNAi載

24、體經(jīng)Hpa I 和Xho I酶切后，瓊脂糖凝膠電泳顯示載體中位于兩酶切位點(diǎn)間的原有片段被分離，載體被切割成線性，見圖1。挑選陽性克隆送測(cè)序，陽性克隆測(cè)序結(jié)果，見圖1。證明大鼠miRNA-9-1慢病毒載體構(gòu)建成功。慢病毒載體系統(tǒng)的3個(gè)質(zhì)粒pGC-LV、pHelper 1.0和pHelper 2.0按一定比例共感染293T細(xì)胞，收集感染后48 h的293T細(xì)胞上清液，進(jìn)行離心濃縮。取濃縮的病毒液用孔稀釋法進(jìn)行病毒滴度（titer，T）測(cè)定，T= 1×1012 TU/L（TU, transduction unit）。2 MicroRNA-9-1慢病毒感染 本研究采用含有綠色熒光報(bào)告基因（G

25、FP）標(biāo)記的病毒載體觀察、評(píng)估感染效率。倒置熒光顯微鏡觀察感染24 h，可以觀察到部分綠色熒光，感染4 d時(shí)GFP表達(dá)最理想，感染組和陰性對(duì)照組GFP感染率沒有明顯差異，見圖2、表2。3 MTT結(jié)果感染前各組MSCs的MTT結(jié)果無顯著差異（P>0.05）；感染24 h，感染組MTT值顯著下降，與各對(duì)照組MTT值比較均有顯著差異（P<0.05），各對(duì)照組之間無顯著差異。感染48 h、72 h、96 h后MTT值雖較24 h有所上升（P<0.05），但與其他組MTT比較仍有顯著差異（P<0.05），見表3。4 -巰基乙醇體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞未感染組MSCs誘導(dǎo)5

26、h，部分細(xì)胞出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞改變，胞體收縮呈多角形或圓形，突起細(xì)長(zhǎng)，有數(shù)個(gè)分支，部分在局部形成網(wǎng)絡(luò)。感染micro-RNA-9-1-LV組誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)變化更為迅速和顯著，誘導(dǎo)5 h多數(shù)細(xì)胞胞體收縮呈圓形、錐形，細(xì)胞突起細(xì)長(zhǎng)，交織成網(wǎng)，形成較典型的神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，少量細(xì)胞脫落、死亡。陰性對(duì)照組和未感染組類似，見圖3。5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法感染組誘導(dǎo)5 h，NSE和MAP-2的表達(dá)率分別為87.2% ± 2.0%和85.5% ± 0.8%，顯著高于其它各組（P<0.05）。各組GFAP表達(dá)率均小于1%，無顯著性差異，見圖4、表4。6 RT-PCR結(jié)果3組分別誘導(dǎo)分化5 h均

27、表達(dá)MAP-2 mRNA，未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組無顯著差異，感染microRNA-9-1組表達(dá)MAP-2 mRNA較前2組明顯增高，有顯著差異，見圖5、圖6。討 論1 慢病毒載體感染技術(shù) 慢病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體包容量大，能夠感染任何類型神經(jīng)細(xì)胞，其攜帶的目的基因可整合到宿主細(xì)胞基因組使外源基因獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，且不編碼病毒蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也不會(huì)引起免疫反應(yīng)5。在人和小鼠腦組織中成熟的microRNA-9有3種不同形式，microRNA-9-1、-9-2和-9-3，其原始轉(zhuǎn)錄本分別位于3、13、7號(hào)染色體上。通過用維甲酸處理小鼠P19細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，microRNA-9-1在誘導(dǎo)后有明顯變化，經(jīng)歷急劇

28、上升至迅速下降過程，且處理后神經(jīng)特異性標(biāo)志物MAP-2逐漸上升，提示microRNA-9-1在神經(jīng)分化中起著重要調(diào)控作用和生物指示作用6。據(jù)此本研究采用采用三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)即pGC-LV載體、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體來構(gòu)建慢病毒載體，建立microRNA-9-1增強(qiáng)體外模型，并探討其在MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞中的作用。2 MicroRNA-9在MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化中的作用 MicroRNA可以作為發(fā)育開關(guān)以及微調(diào)發(fā)育程序來調(diào)控生物體內(nèi)多種發(fā)育過程7。MicroRNA-9是腦組織特異表達(dá)的一種小RNA，它在小鼠胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的分化中其重要調(diào)控作用8。研究發(fā)現(xiàn)

29、，microRNA-9在神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化過程中起重要調(diào)控作用9，通過影響轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3信號(hào)通路來促進(jìn)神經(jīng)分化5。通過Fgf信號(hào)通路調(diào)控中腦后腦交接區(qū)（midbrain-hindbrain boundary，MHB）的組織活性10。 Krichevsky等4研究發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育的第5階段microRNA-9/9*表達(dá)較高，此階段是神經(jīng)元前體向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化的關(guān)鍵時(shí)期，抑制神經(jīng)前體細(xì)胞中microRNA-9表達(dá)可使神經(jīng)元數(shù)量減少29% - 31%。MicroRNA-9調(diào)控著由胚胎干細(xì)胞衍生來的神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖和遷移，由其直接調(diào)控的一個(gè)靶基因可以編碼一種19 kD的磷酸蛋白stat

30、hmin，該蛋白特異性在神經(jīng)祖細(xì)胞上表達(dá)，可以增加微觀的不穩(wěn)定性，從而促進(jìn)細(xì)胞定向遷移11,12。本研究發(fā)現(xiàn)感染microRNA-9-1慢病毒載體的MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化效率增加，考慮可能和microRNA-9的上述作用有關(guān)。MSCs是一種成體干細(xì)胞，可以向骨、軟骨、脂肪等多種組織分化，研究發(fā)現(xiàn)其可以向神經(jīng)細(xì)胞分化13,14。與神經(jīng)干細(xì)胞定向分化所不同，MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞是一種橫向分化方式，其調(diào)控因子目前了解較少。Greco等3發(fā)現(xiàn)在人MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞過程中，microRNA在其中起著重要調(diào)控作用。但與神經(jīng)干細(xì)胞分化機(jī)制是否相同，microRNA-9是否參與分化過程尚未見報(bào)道。本研究

31、首次采用感染microRNA9-1慢病毒載體，構(gòu)建microRNA-9-1增強(qiáng)模型，觀察其在MSCs誘導(dǎo)分化中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-9-1慢病毒載體可高效感染小鼠MSCs，感染后報(bào)告基因GFP可穩(wěn)定表達(dá)。本研究MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染microRNA-9-1慢病毒后，MSCs存活率下降，但感染僅含有報(bào)告基因的慢病毒載體后MSCs存活率變化不大，表明microRNA-9在MSCs保持細(xì)胞自我更新、分裂、凋亡等生理功能中起到一定作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與未感染和感染僅含有GFP的慢病毒的MSCs相比感染microRNA9-1慢病毒后，MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化效率顯著提高，神經(jīng)細(xì)胞早、中期標(biāo)志物

32、NSE和成熟神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物MAP-2表達(dá)均明顯增高，且未見GFAP表達(dá)。這提示microRNA-9-1可能在MSCs橫向分化神經(jīng)細(xì)胞中起作用，提高microRNA-9-1的表達(dá)，可以促進(jìn)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。單獨(dú)感染microRNA-9-1慢病毒并不能使MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，還必須在誘導(dǎo)劑（-巰基乙醇等）的作用下才能分化。這說明microRNA9-1在MSCs在橫向分化為神經(jīng)細(xì)胞過程中不是唯一的，可能是對(duì)一些信號(hào)途徑調(diào)控，如Notch信號(hào)途徑15，從而提高誘導(dǎo)效率。但是具體機(jī)制尚不明確。綜上所述，本研究采用慢病毒感染技術(shù)，建立microRNA-9-1過表達(dá)細(xì)胞模型，從而促進(jìn)MSCs向

33、神經(jīng)細(xì)胞的分化效率，提示microRNA-9-1在MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞過程中可能起促進(jìn)作用。參考文獻(xiàn)1 Lagos-Quintana M, Rauhut R, Yalcin A, et al. Identification of tissue-specific microRNAs from mouseJ. Curr Biol, 2002, 12 (9):735-739.2 原清濤, 鄧宇斌, 李樹濃. 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元及其應(yīng)用的研究進(jìn)展J. 中國病理生理雜志, 2004, 20(11):2139-2142.3 Greco SJ, Rameshwar P. MicroRNAs

34、 regulate synthesis of the neurotransmitter substance P in human mesenchymal stem cell-derived neuronal cellsJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104 (39):15484-15489.4 Krichevsky AM, Sonntaq KC, Isacson O, et al. Specific microRNAs modulate embryonic stem cell-derived neurogenesisJ. Stem Cells, 2006,

35、 24 (4):857-864.5 Simmons A, Whitehead RP, Kolokoltsov AA, et al. Use of recombinant lentivirus pseudotyped with vesicular stomatitis virus glycoprotein G for efficient generation of human anti-cancer chimeric T cells by transduction of human peripheral blood lymphocytes in vitroJ. Virol J, 2006, 3:

36、8.6 Ko MH, Kim S, Hwang do W, et al. Bioimaging of the unbalanced expression of microRNA9 and microRNA9* during the neuronal differentiation of P19 cellsJ. FEBS J, 2008, 275 (10):2605-2616.7 Krol J, Loedige I, Filipowicz W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay J. Nat

37、Rev Genet, 2010, 11 (9):597-610.8 Delaloy C, Gao FB. microRNA-9 multitasking near organizing centersJ. Nat Neurosci, 2008, 11 (6):625-626.9 Conaco C, Otto S, Han JJ, Mandel G. Reciprocal actions of REST and a microRNA promote neuronal identityJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103 (7):24222427.10 Le

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40、to produce the neurotransmitter substance P by interleukin-1J. Stem cells, 2005, 23 (3):383-391.14 施雪英, 陳先文, 胡慧敏, 等. 三七總皂苷和維甲酸聯(lián)合誘導(dǎo)大鼠MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞J. 中國病理生理雜志, 2007, 23(3):612-613.15 Wang Z, Li Y, Kong D, et al. Cross-talk between miRNA and Notch signaling pathways in tumor development and progression

41、J. Cancer Lett, 2010, 292 (2):141-148.Figure 1. PCR results for constructed microRNA-9-1-LV vector. A: enzyme-digested product. 1: marker; 2: the pFU-GW-RNAi plasmid without digestion; 3: the pFU-GW-RNAI plasmid digested by Xba I and Hpa I. B: PCR for cloned target gene. 1: the group with ddH2O; 2:

42、the group with empty vector; 3: the group with GAPDH; 4: marker; 5-12: the groups with transformants of microRNA-9-1.圖1 慢病毒載體構(gòu)建PCR結(jié)果Figure 2. The cell infection rate (48 h after transfection, ×200). A: transfected group; B: negative control group.圖2 慢病毒感染24 h細(xì)胞感染率Figure 3. -ME induced MSCs into

43、 neurons (×200). A: transfected group; B: negative control group.圖3 -巰基乙醇誘導(dǎo)各組MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化Figure 4. Expression of MAP-2 in -ME-induced differentiation of MSCs into neurons (5 h after induction, ×200). A: transfected group; B: negative control group.圖4 -巰基乙醇誘導(dǎo)各組MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中MAP-2的表達(dá)Figure 5. The RT-PCR for MAP-2. A: transfected group；B: negative control group; C: non-transfected group.圖5 MAP-2 RT-PCR結(jié)果Figure 6. MAP-2 mRNA expression. Mean±SD. n = 15. * P<0.05 vs other groups