實時熒光定量PCR檢測傳代培養(yǎng)細(xì)胞Grb10的表達(dá)

1、實時熒光定量PCR檢測傳代培養(yǎng)細(xì)胞Grb10的表達(dá) 作者：楊曉煜， 姚建鳳， 黃燕芳， 張孟璋【摘要】 目的 建立一種可靠的Grb10印跡基因?qū)崟r熒光定量PCR方法，檢測傳代培養(yǎng)鼠尾成纖維樣細(xì)胞中Grb10表達(dá)的差異。 方法 通過實時熒光PCR，選擇合適的“相對標(biāo)準(zhǔn)品”繪制相對標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測傳代培養(yǎng)細(xì)胞中印跡基因Grb10的表達(dá)水平。結(jié)果 相對標(biāo)準(zhǔn)曲線有較好的線性（r=0.999及0.984）；實時熒光定量PCR方法檢測出隨著細(xì)胞培養(yǎng)代數(shù)的增加印跡基因Grb10表達(dá)水平上升。 結(jié)論 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR法用于檢測Grb10的表達(dá)準(zhǔn)確可靠；傳代培養(yǎng)可能影響鼠尾成纖維樣細(xì)胞中印跡基因Gr

2、b10的表達(dá)水平。 【關(guān)鍵詞】 聚合酶鏈反應(yīng)； 等位基因； 基因表達(dá)； 蛋白質(zhì)類； 細(xì)胞，培養(yǎng)的； Grb10Grb10是母本等位基因特異表達(dá)的印跡基因，通過編碼特殊的銜接蛋白結(jié)合酪氨酸激酶受體，調(diào)節(jié)特定的信號傳遞過程。印跡基因表達(dá)的一個特點是依賴等位基因的親本來源，即優(yōu)先表達(dá)來自父本或母本的等位基因1。某一親本等位基因的沉默是通過染色體的表觀遺傳修飾來完成的，染色體的修飾對基因轉(zhuǎn)錄密不可分，主要包括DNA甲基化和組蛋白修飾。因此，檢測小鼠印跡基因Grb10在經(jīng)體外培養(yǎng)后表達(dá)水平的差異，是研究培養(yǎng)過程中表觀遺傳修飾影響印跡基因Grb10表達(dá)水平的重要基礎(chǔ)。 實時熒光定量PCR是近年來使用的一種

3、核酸檢測技術(shù)，因高精確度、高靈敏性、污染少等優(yōu)點已在生物醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)科研及醫(yī)學(xué)臨床中得到廣泛應(yīng)用。它是利用每一模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存著的線性關(guān)系，來定量模板初始拷貝數(shù)，從而實現(xiàn)極為精確的核酸定量檢測。綜合比較實時熒光PCR絕對定量和相對定量的各種方法，同時結(jié)合試驗?zāi)康?，筆者采用一種新的實時熒光定量PCR的方法來檢測印跡基因Grb10的表達(dá)，即通過合適的相對標(biāo)準(zhǔn)品、系列稀釋后構(gòu)建相對標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得與絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線一致的斜率。因為定量結(jié)果只與曲線的斜率相關(guān)2，因此，可以實現(xiàn)比傳統(tǒng)的相對定量法（2- C T法）更為準(zhǔn)確的定量結(jié)果，并且避免了絕對定量的復(fù)雜度和難度。1 材料和方法1.

4、1 材料 雜交鼠B6D2F1(C57BL/6 x DBA2，68周齡)，購自國家嚙齒類實驗動物種子中心上海分中心合格證號：SCXK（滬）20030003。細(xì)胞培養(yǎng)用試劑購自上海水源生物技術(shù)服務(wù)公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自東洋紡生物科技有限公司（ReverTra AceTM, TOYOBO）。SYBR Green I熒光定量試劑盒購自大連TaKaRa公司(SYBR Premix Ex TaqTM TaKaRa)。其余試劑無特別說明均購自美國Sigma公司。 定量PCR的Grb10、Gapdh引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。RNA定量采用紫外分光光度計（ND100，美國Thermo公司），實時

5、定量采用實時熒光定量 PCR儀（7500，美國ABI公司）。1.2 鼠尾成纖維樣細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)3。剪約1 cm鼠尾組織，消毒后用培養(yǎng)液反復(fù)沖洗，轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)皿，剪切至約1 mm1 mm1 mm組織塊，移入濕潤過的培養(yǎng)瓶，均勻擺布至瓶底，相互距離約0.5 cm。輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，瓶底向上，加入1 mL培養(yǎng)液（DMEM/F12，添加10%FBS和0.10.25%雙抗），輕晃動使之分布均勻，置36.5 溫箱倒置培養(yǎng)約48 h，待其組織塊貼壁，再緩緩把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋已貼附瓶底的組織塊。培養(yǎng)約1周后，可見成纖維樣細(xì)胞從組織塊游離長出，適當(dāng)添加培養(yǎng)液，獲得原代成纖維樣細(xì)胞。待其長滿至約

6、80%瓶底，連續(xù)傳代過程中收集P1及P5細(xì)胞。1.3 總RNA的提取與cDNA的合成1.3.1 總RNA的提取與定量 收集P1及P5細(xì)胞，重懸、計數(shù)、離心（1 200 r/min，5 min），沉淀中加入Trizol，吹打后加入三氯甲烷，離心（1 200 r/min，5 min），沉淀加入丙醇；離心（1 200 r/min，5 min），乙醇洗滌，得到的RNA用焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解，用紫外分光光度計定量，-80 保存。1.3.2 cDNA合成 選擇完整性良好的RNA樣本，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。20 L體系中含總RNA 100 ng，5緩沖液 4 L，dNTP mix（10

7、 mmol/L）2 L，抑制劑(10 mol/L) 1 L，逆轉(zhuǎn)錄酶 1 L，Oligo(dT) 1 L，最后無RNA酶H2O至20 L。逆轉(zhuǎn)錄程序為：42 20 min99 5 min4 5 min，cDNA放-20 待測。1.4 實時熒光定量RTPCR1.4.1 相對標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 取2 g待測樣本RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，5倍系列稀釋后，得到標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度設(shè)為1，0.2，0.04，0.008，0.0016，相對標(biāo)準(zhǔn)品用于制作雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板。1.4.2 實時熒光定量 PCR 使用擴增儀，按照試劑盒說明書進(jìn)行，在20 L反應(yīng)體系中含2SYBR Premix Ex Taq 10 L（內(nèi)含TaKaR

8、a Ex TaqTM HS，dNTP mix，Mg2+和SYBR Green I），50ROX Reference Dye 0.4 L，上下游引物（10 mol/L）各0.2 mol/L，待測樣本的cDNA或梯度濃度的定量模板。引物大小及其序列（53）：Grb10（315 bp） 上游：CACGAAGTTTCCGCGCA 下游：AGTATCAGTATCAGACTGCATGTTGGapdh（150 bp） 上游：TGTGTCCGTCGTGGATCTGA 下游：TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG1.4.3 PCR反應(yīng)條件 95 10 s95 5 s60 34 s，40個循環(huán)；95 15 s

9、60 1 min95 15 s。各待測樣本及各梯度濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)品均做2個平行管，熒光定量分析軟件自動繪制擴增動力曲線溶解曲線。通過溶解曲線分析實時熒光定量 PCR反應(yīng)產(chǎn)物的純度以判斷實驗的特異性。PCR反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)熒光定量分析軟件，算出各待測樣品的相對初始拷貝數(shù)。1.4.4 驗證PCR擴增產(chǎn)物 采用瓊脂糖凝膠電泳法，并于紫外燈下觀察擴增片段大小及特異性。1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以(xs)表示，采用SPSS Ver 13.0軟件。配對樣本t檢驗。2 結(jié)果2.1 電泳鑒定總RNA的完整性 RNA電泳可見3條rRNA條帶，分別為28，18，5.8 S(5 S)，在紫外燈下亮度依次為28 S18

10、S5.8 S(5 S)，且28 S的亮度大致是18 S的2倍，5.8 S條帶弱（圖1）。可以認(rèn)為所提取的RNA質(zhì)量好，未被降解，可用于實時熒光定量PCR分析。圖1 RNA的電泳結(jié)果（略）Fig 1 The results of RNA electrophoresis2.2 實時熒光定量PCR反應(yīng) （1）實時擴增曲線（圖2）。S型的擴增動力曲線，有明顯的指數(shù)擴增期、有平臺期，并且曲線起峰約在CT值為21，整條曲線走行光滑，顯示擴增結(jié)果理想。（2）溶解曲線（圖3）。分別顯示目的基因Grb10和內(nèi)參基因Gapdh PCR擴增后的溶解曲線，其熔點峰分別位于88.6 和85.9 ，峰形窄而尖，無雜峰，擴

11、增產(chǎn)物特異性良好。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）。顯示5倍梯度稀釋的相對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR擴增后，各自得到目的基因Grb10和內(nèi)參基因Gapdh標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線擬合度良好，斜率(slope)分別為-3.2062和-3.4673，其直線相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.9838和0.9987，直線相關(guān)性好，可在較寬廣的范圍內(nèi)進(jìn)行定量分析。橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強度.圖2 實時熒光定量PCR擴增曲線（略）Fig 2 Application curve in Realtime PCR2.3 確認(rèn)PCR產(chǎn)物 于315 bp和150 bp處可見2條清晰電泳條帶，與理論值大小一致，其分別為目的基因Grb10和內(nèi)參基因Ga

12、pdh，此外未見其他雜帶（圖5）。2.4 定量分析結(jié)果 通過內(nèi)參基因Gapdh定量結(jié)果對目的基因Grb10定量值進(jìn)行歸一化處理后，以Grb10/Gapdh比值（K）表示基因Grb10表達(dá)水平，得到各樣本K值見表2。體外傳代培養(yǎng)過程中的鼠尾成纖維樣細(xì)胞（P1和P5），其Grb10 表達(dá)水平分別為（1.51010.1074）和（1.73260.0735），二者比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.042）。a：Grb10；b：Gapdh. 橫坐標(biāo)為溫度（），縱坐標(biāo)為熒光變化速度圖3 目的基因Grb10和內(nèi)參基因Gapdh溶解曲線（略）Fig 3 Dissociation curve for Grb10 and

13、 Gapdha：Grb10; b：Gapdh. 橫坐標(biāo)為相對表達(dá)量（對數(shù)顯示），縱坐標(biāo)為Ct值.圖4 目的基因Grb10和內(nèi)參基因Gapdh標(biāo)準(zhǔn)曲線（略）Fig 4 Standard curve for Grb10 and Gapdh圖5 電泳示PCR產(chǎn)物（略）Fig 5 PCR products showed by DNA electrophoresis表 2 Grb10 相對表達(dá)水平（略）Tab 2 Relative expression of Grb10A,B,C：來源于3只不同個體小鼠的鼠尾組織植塊培養(yǎng)法得到的成纖維樣細(xì)胞.3 討論 傳統(tǒng)的相對定量法是用2- C T來計算實驗組相對于對

14、照組目的基因表達(dá)的變化倍數(shù)，其前提條件是各反應(yīng)管擴增效率一致且PCR擴增效率接近100%，但在實際中，目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率不可能完全相同，對定量結(jié)果的分析產(chǎn)生影響；同時，擴增效率往往隨著循環(huán)數(shù)的增加、引物和底物濃度的降低而下降；反復(fù)熱變性使DNA酶活性降低，也會導(dǎo)致擴增效率下降，諸多存在因素決定實際PCR擴增效率不可能達(dá)到100%，并且會低于0.645。因此，為克服2 C T的定量結(jié)果與實際結(jié)果之間的差距，在實驗中筆者應(yīng)用一種新的實時熒光定量PCR法，分析傳代培養(yǎng)細(xì)胞印跡基因Grb10相對表達(dá)水平。與傳統(tǒng)PCR相比，實時熒光定量PCR可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，更快速、靈敏地

15、對待測樣本mRNA進(jìn)行定量或半定量分析。 新的實時熒光定量PCR法是通過雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行半定量分析，以“相對標(biāo)準(zhǔn)品”代替絕對定量中的“絕對標(biāo)準(zhǔn)品”，設(shè)定各梯度濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為n、5n、25n、125n、625n (n0)。同時，為避免同一管擴增中目的基因和內(nèi)參基因擴增是對模板和原料的競爭性，筆者于不同PCR反應(yīng)管中分別擴增目的基因和內(nèi)參基因，分別得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過曲線的斜率可以計算待測樣本相對初始拷貝數(shù)，獲得的相對定量再通過內(nèi)參基因進(jìn)行均一化處理（K值表示）。該方法既簡化了絕對定量試驗的繁瑣過程，又準(zhǔn)確可靠的分析不同樣本之間目標(biāo)基因表達(dá)的差異2,6。為證明標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性和克服加樣誤差

16、，筆者進(jìn)行了重復(fù)性試驗，試驗中2平行管擴增曲線圖，表現(xiàn)了良好的重復(fù)性。此外，擴增產(chǎn)物定量的準(zhǔn)確性有賴于得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線擬合度越高，即斜率(slope) 在-2.99和-3.99，相關(guān)系數(shù)（r）越接近1（r0.98），可信度越高。實驗得到Grb10和Gapdh雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）分別達(dá)到98.38和99.87%，有很好的線性關(guān)系，故可以在寬廣的范圍內(nèi)對目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，可以用于mRNA定量分析。 本實驗采用SYBR Green染料法進(jìn)行mRNA表達(dá)相對定量分析，簡便又快速地實時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)過程，同時還可以通過溶解曲線分析以識別擴增產(chǎn)物，排除非特異性擴增。實驗中，目的基因G

17、rb10和內(nèi)參基因可見窄而尖的溶點峰，表明實驗中無出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴增，產(chǎn)物純度高。在PCR結(jié)束后通過凝膠電泳成像分析進(jìn)一步明確了擴增產(chǎn)物的特異性?？梢姡摲磻?yīng)體系完好，PCR擴增特異性高，可信度高，可用于統(tǒng)計學(xué)分析。實驗結(jié)果顯示，鼠尾成纖維樣細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過程中印跡基因Grb10 表達(dá)水平上調(diào)。印跡基因是表觀遺傳學(xué)的重要組分之一，組織培養(yǎng)容易誘導(dǎo)基因表達(dá)發(fā)生改變，這與生物體在接受各種內(nèi)在或外在應(yīng)激時，為更好適應(yīng)生存環(huán)境而發(fā)生某些特定基因表達(dá)的改變是相類似的7。體外培養(yǎng)因脫離體內(nèi)調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)機制，往往導(dǎo)致一些環(huán)境變異因素，如激素、生長因子、毒素、飲食性甲基團供給不足等，從而可能發(fā)生

18、基因組整體甲基化水平的降低810。哺乳動物印跡基因表達(dá)水平的改變與表觀遺傳修飾的改變密切相關(guān)。 在對胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，Sanjeev等發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中的血清可以使多個生長相關(guān)性的印跡基因的表達(dá)發(fā)生改變；同樣植入前胚胎進(jìn)行一段時間的體外培養(yǎng)后，發(fā)生印跡基因表達(dá)脫調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致胎兒生長和發(fā)育的異常改變11。母本等位基因表達(dá)的Grb10印跡基因編碼的銜接蛋白生長因子10作用于IGF/INS軸，經(jīng)由SH2區(qū)域與IGF1受體和胰島素受體結(jié)合，阻斷細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，對細(xì)胞增殖起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。因鼠尾成纖維樣細(xì)胞是小鼠克隆的重要供核細(xì)胞，作為供核細(xì)胞已成功克隆出小鼠3，故本實驗選擇鼠尾成纖維樣細(xì)胞，對其

19、進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)研究，檢測到印跡基因Grb10表達(dá)水平發(fā)生了改變，在一定程度上補充了印跡基因Grb10相關(guān)方面的研究；同時為探討小鼠克隆中基因印跡的表觀遺傳重編程機制提供實驗依據(jù)。欲進(jìn)一步闡釋傳代培養(yǎng)中發(fā)生Grb10表達(dá)水平改變的具體機制，下一步將對其相關(guān)的表觀遺傳修飾進(jìn)行研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 楊曉煜,戴 博. 基因的重新編程與哺乳動物克隆J. 中國生物工程雜志, 2003,23(8):1822.2 張池宇,徐順高,黃新祥. 一種新穎簡便的實時熒光定量RTPCR相對定量方法的建立J. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2005,32(9):883888.3 Ogura A,Inoue K,Takan

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