安捷倫Cary 60 光纖測試樣品

1、 作者*Fyfe, DJ 和Comerford, JC*Fyfe 科技公司, West LakesShore, SA 5020, 澳大利亞*安捷倫科技公司, 679 Springvale Road, Mulgrave 3179, 澳大利亞安捷倫Cary 60 紫外-可見分光光度計配置微光纖探頭測定4°C下微量DNA 的純度應(yīng)用摘要醫(yī)藥/生物技術(shù)總結(jié)安捷倫Cary 60 紫外-可見分光光度計是在儲存環(huán)境（如冰箱）下直接測定微量生物樣品的理想儀器。本應(yīng)用報告展示了如何使用Cary 60 及其微光纖探頭附件測定4 °C下的DNA 純度結(jié)果表明，使用該儀器能夠大幅節(jié)省時間和成本，同

2、時數(shù)據(jù)精確度和重現(xiàn)性毫無損失。不再需要比色皿直接測定4 °C冰箱中的樣品節(jié)省每次分析的時間與成本前言多年以來，紫外-可見分光光度計一直是生物技術(shù)領(lǐng)域中測定DNA 純度和濃度的一項重要工具。該方法最早由Warburg 和Christian 在1942 年開發(fā)1，隨后由Sambrook 等人在1989 年進(jìn)行了優(yōu)化，使其可用于實驗室中簡便、快速的測定2。分光光度法的主要優(yōu)點在于測定過程：1 簡便；2 準(zhǔn)確；3 不破壞樣品。這一方法可以節(jié)省時間而不損失數(shù)據(jù)質(zhì)量，并且在測定過程中無需使用大體積的樣品或額外的耗材，從而帶來經(jīng)濟(jì)效益。在之前的文章中，我們介紹了安捷倫Cary 50 紫外-可見分光

3、光度計配置Hellma （德國Hellma GmbH & Co.）的Traycell 微量比色池紫外-可見在室溫下準(zhǔn)確、可重現(xiàn)地測定微量DNA 的方法3。在本研究中，我們采用帶光纖探頭的Cary 60 紫外-可見分光光度計進(jìn)行了方法擴(kuò)展研究，在4 °C以及普通實驗室環(huán)境光照條件下測定了小體積樣品。本方法使得用戶可以將儀器靠近樣品，而不是像傳統(tǒng)光譜方法那樣將樣品放入儀器中，從而能夠在很短的時間內(nèi)完成分析。Cary 60 獨(dú)有的光學(xué)設(shè)計使這一優(yōu)勢得以實現(xiàn)，它主要憑借其獨(dú)特的高強(qiáng)度閃爍氙燈以及最新型的電子器件，使系統(tǒng)能夠有效地監(jiān)控吸光度的微小變化而不受環(huán)境背景光的任何影響。本文深入

4、討論了這一方法的主要優(yōu)點。儀器與材料方法與結(jié)果將小牛胸腺DNA 用純凈水（MilliQ ）稀釋得到不同濃度的樣品，濃度范圍050 µg/ml。配有光纖耦合器以及微探頭的Cary 60, 如圖1所示。在Eppendorf 管中加入150 µL純凈水（MilliQ ），將其讀數(shù)作為空白。由于分子生物學(xué)試劑通常保存于冷藏條件下，因此所有樣品直接從4 °C冰箱中取出并進(jìn)行分析。 圖 1. 配有光纖附件的Cary 60 測試4 °C下Eppendorf 管中150 L DNA 的示意圖。開始時，使用WinUV 軟件“掃描”模塊在340 到240 nm 范圍進(jìn)行掃描

5、以確認(rèn)最大吸收峰以及所購買的按50:50 稀釋的DNA 樣品的可靠性（圖2）。 (nm圖2. 對4 °C下兩個濃度的150 µL DNA 樣品的掃描表明特征吸收峰出現(xiàn)在260nm 處。注意：50 µg/ml DNA 最大吸光度值1.0Abs ，25 µg/ml DNA 最大吸光度值0.5Abs ，遵守Beer Lambert 定律（A = cl）。為了確認(rèn)DNA 的純度，使用WinUV 軟件專門的RNA/DNA”模塊測定260/280 比率，該模塊可自動計算DNA 樣品的純度。如圖3 所示，這一模塊使用非常簡單，可以在一分鐘內(nèi)完成分析?！皥D3. 簡便、專

6、用的Cary WinUV 自動計算DNA 的純度、可靠性和濃度最后，繪制濃度曲線以評估同一實驗室條件下不同濃度DNA 樣品讀數(shù)的線性和重現(xiàn)性（圖4）。在兩個DNA 樣品讀數(shù)間隙使用MilliQ 純凈水清洗微探頭。圖4. 使用微探頭光纖附件在實驗室常規(guī)光照條件下測定4 °C下Eppendorf 管中50 µL DNA 樣品（050 µg/mL）得到的濃度曲線。校準(zhǔn)方程：Abs = 0.02393*濃度；相關(guān)系數(shù)= 0.99126。討論測定五個樣品所用的時間不到兩分鐘。傳統(tǒng)方法使用微量比色皿，需要等待樣品加熱至室溫，而且在每兩次測定間需要清洗微量比色皿?？傊褂肅a

7、ry 60 光纖系統(tǒng)可以顯著降低大約80% 的分析時間，同時采用光纖技術(shù)不易受到樣品處理引起的潛在污染。使用微探頭可以獲得高精度的數(shù)據(jù)并大大縮短測定低溫樣品所需的時間，這表明Cary 60是一種適于測定生物樣品（如DNA ）的簡便、快速且高性價比的系統(tǒng)。本方法可以輕松地直接擴(kuò)展到其它樣品類型，例如可在280 nm 處測定蛋白質(zhì)。結(jié)論Cary 60 紫外-可見分光光度計是使用光纖采樣的理想儀器，它獨(dú)有的高強(qiáng)度閃爍氙燈可以提供卓越的靈敏度和重現(xiàn)性。本應(yīng)用報告所展示的測定DNA 樣品時的分析速度、結(jié)果重現(xiàn)性以及易用性證明了該儀器系統(tǒng)的強(qiáng)大優(yōu)勢。使用帶光纖的Cary 60 分析生物樣品還具有如下優(yōu)點：

8、可以直接測定高溫或低溫樣品（4 °C 110°C）而無需考慮冷凝的問題，如果使用比色皿則由于冷凝可能導(dǎo)致結(jié)果不正確或重現(xiàn)性不好樣品體積不受限制，可以低至40 µL，也可以無限大無需購買昂貴的石英微量比色皿，更節(jié)省了清洗比色皿的時間 使用反射探頭還可以分析固體、粉末或凝膠類樣品1. Warburg, O. and Christian, W. (1942 Biochem Z.,310; 384.2.Sambrook, J., Fritsch, EF. and Manniatis, T. (1989 Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring HabrorLaborato