實(shí)時RT_PCR基因表達(dá)相對定量REST_軟件分析與2_CT_法比較

1、文章編號（）基礎(chǔ)研究論著）實(shí)時基因表達(dá)相對定量"軟件分析與（法比較庾蕾，劉建平，莊志雄，楊淋清，張仁利，葉小明，程錦泉（深圳市疾病預(yù)防控制中心分子生物學(xué)研究室，深圳；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，武漢）摘要】目的【利用實(shí)時技術(shù)建立一種簡便、準(zhǔn)確的基因表達(dá)相對定量方法。方法以正常的人支氣管上皮細(xì)胞株（）為模板倍系列稀釋，分別作聚合酶（）和磷酸甘油醛脫氫酶（）基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。以不同劑量反式二羥環(huán)氧笨并芘（）誘導(dǎo)的、轉(zhuǎn)化的及肺癌細(xì)胞株（）為模板，進(jìn)行實(shí)時定量。以基因作為內(nèi)參照，進(jìn)行基因表達(dá)）相對定量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別采用（法及"軟件分析。結(jié)果倍系列稀釋法制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，呈現(xiàn)較好）

2、法計(jì)算出的表達(dá)的線型關(guān)系（）。及基因擴(kuò)增效率分別為和。采用（結(jié)論比值均比"軟件分析高。定量分析手段。實(shí)時技術(shù)結(jié)合"軟件分析是一種簡便、準(zhǔn)確的基因表達(dá)相對關(guān)鍵詞】實(shí)時；相對定量；標(biāo)準(zhǔn)曲線；基因表達(dá)【中圖分類號：文獻(xiàn)標(biāo)識碼：）!（，（，；，）【】（）"（），（""【】；分子流行病學(xué)研究中一個非常重要的內(nèi)容，就是在群體研究基礎(chǔ)上，從分子或基因水平探索疾病的病因和發(fā)病機(jī)理。目前，實(shí)時已成為基因表達(dá)定量的強(qiáng)有力的工具，具有高敏感、重復(fù)性好及定量范圍廣的特點(diǎn)，特別是定量低豐度的及揭示微小的基因表達(dá)變化。由于其操作簡單而被廣泛應(yīng)用，但傳統(tǒng)的（!）法定量誤差大

3、。本文介紹了一種簡便、準(zhǔn)確的基因表達(dá)相對定量實(shí)時方法包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理?；痦?xiàng)目：深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（）。作者簡介：庾蕾（），女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事生物化學(xué)與分子毒理學(xué)研究。材料與方法材料采用的細(xì)胞株為永生化人支氣管上皮細(xì)胞株（）。通訊作者：程錦泉，博士，主任醫(yī)師，：熱帶醫(yī)學(xué)雜志年月第卷第期、轉(zhuǎn)化的及肺癌細(xì)胞和純品由廣州醫(yī)學(xué)院化學(xué)致癌研究所紀(jì)衛(wèi)東博士贈送。方法細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)個樣本設(shè)個復(fù)孔，同時設(shè)置無模板對照（）。以基因作為內(nèi)參照，進(jìn)行基因表達(dá)相對定量。儀器軟件（公司產(chǎn)品）自動分析給出基因相對表達(dá)量）（）或表達(dá)比值（）。細(xì)胞用含小牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)。誘導(dǎo)：儲存液（溶解）用

4、含小牛血清的培養(yǎng)液稀釋成終濃度分別為、的溶液。待細(xì)胞長至數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別采用下列種方法分析。）法：儀器軟件自動分析給出表達(dá)比值，使用（統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析；%軟件分析：在相應(yīng)界面輸入標(biāo)準(zhǔn)曲線及基因表達(dá)相對定量值，軟件分析給出表達(dá)比值及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。融合時，棄上清，加入含的培養(yǎng)液，誘導(dǎo)，用洗次，細(xì)胞按傳代，待細(xì)胞長至融合時，再加誘導(dǎo)，共次，以小牛血清培養(yǎng)液作為對照。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建以正常為模板，分別采用倍、倍及。總提取收集細(xì)胞，用試劑（公司產(chǎn)品），按照試劑盒操作步驟提取總合成以各處理組的總為模板進(jìn)行逆倍系列稀釋制作和基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明倍系列稀釋呈現(xiàn)較好的線型關(guān)系（）。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用試劑

5、盒（公司）。反應(yīng)緩沖體系含隨機(jī)引物（）逆轉(zhuǎn)錄酶（）、酶抑制劑、及基因擴(kuò)增效率分別為、和，基本一致（圖，圖）。熒光值（）、各及總。于儀（，公司產(chǎn)品），。實(shí)時定量基因表達(dá)分析探針及引物設(shè)計(jì)基因表達(dá)分析的引物、探針用軟件（公司產(chǎn)品）設(shè)計(jì)（表），由上?；瞪锛夹g(shù)公司合成。表基因表達(dá)分析的引物探針序列循環(huán)數(shù)基因引物（）探針（）圖標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增曲線值（）：代表，代表基團(tuán)實(shí)時定量采用試劑盒（公司產(chǎn)品）。反應(yīng)緩沖體系含引物各、探針、參考染料及。反應(yīng)在熒光定量儀（公司產(chǎn)品）上進(jìn)行。反應(yīng)條件：預(yù)變性，再，個循環(huán)。初始模板相對定量值標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以正常為模板，圖基因標(biāo)準(zhǔn)曲線分別進(jìn)行、倍比稀釋。如倍系列稀釋：、。分

6、別作和基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系及條件見，儀器軟件（公司產(chǎn)品）自動分析給出擴(kuò)增效率（，（）。基因相對定量分析）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別采用（法及%軟件分析（表基因表達(dá)相對定量分析以不同劑量）法計(jì)算為，）。如肺癌基因表達(dá)比值采用（）而采用%軟件分析為，可見采用（法分析的誘導(dǎo)的、轉(zhuǎn)化的及肺癌細(xì)胞為模板，進(jìn)行實(shí)時定量，參見。每表達(dá)比值均比%軟件分析高。表基因相對定量表達(dá)比值）法計(jì)算的表達(dá)比值均比"軟件分較，表明采用（劑量（）表達(dá)比值（值）（析高。等指出若目的基因與參考基因的擴(kuò)增效率相差超過，最好采用"軟件分析。采用實(shí)時技術(shù)相對定量基因表達(dá)，關(guān)鍵一步就是標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，即獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，計(jì)算擴(kuò)

7、增效率。一般儀器說明書建議使用倍稀釋法。本文分別采用了倍、倍及倍系列稀釋制作和基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明倍系列稀釋呈現(xiàn)較好的線型關(guān)系（）。總之，實(shí)時技術(shù)與"軟件分析相結(jié)合是一種簡便、準(zhǔn)確的基因表達(dá)相對定量分析手段。參樣本正常"次誘導(dǎo)（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）肺癌轉(zhuǎn)化討論采用實(shí)時技術(shù)進(jìn)行基因表達(dá)分析包括絕對考文獻(xiàn)定量及相對定量法。由于研究者多關(guān)注目的基因的表達(dá)變化，即實(shí)驗(yàn)組與對照組目的基因表達(dá)比值的變化。相對定量法已成為基因表達(dá)分析最常用的手段。目前市面上銷售的熒光定量儀如公司、）公司等多采用的（相對定量法。因其將的擴(kuò)增效俞順章，陳聲林我國分子流行病學(xué)研究進(jìn)展中華流

8、行病學(xué)雜志，（）：，（），（）：張馳宇，徐順高，黃新祥一種新穎簡便的熒光實(shí)時率設(shè)定為，但實(shí)際的擴(kuò)增效率不可能達(dá)到，因此該法計(jì)算出的相對定量結(jié)果通常比實(shí)際結(jié)果要高。"軟件（）是專門設(shè)計(jì)用于實(shí)時技術(shù)相對定量基因表達(dá)分析。其具有如下優(yōu)勢：擴(kuò)增效率的修正，表達(dá)比值（相對定量方法的建立生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，（）：江慶瀾，李瑜元，曾崢，等鹽酸二甲雙胍對非酒精性脂肪肝大鼠脂肪組織腫瘤壞死因子基因表達(dá)的影響中山大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），（）：目的基因（樣品均數(shù)對照均數(shù)，目的基因）（樣品均數(shù)對照均數(shù)，）的計(jì)算包括了目的基因及參考基因的擴(kuò)增效率，結(jié)果更準(zhǔn)）確，并不一定要像（法要求目的基因及參考基因的擴(kuò)，（）：增效率一致；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用簡單的統(tǒng)計(jì)學(xué)隨機(jī)檢驗(yàn)（），克服了傳