新生鼠腦缺血預(yù)處理后海馬CA1區(qū)GAP(1)

1、    新生鼠腦缺血預(yù)處理后海馬CA1區(qū)GAP(1)    】 目的： 觀察新生Wistar鼠腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（GAP43）的表達(dá)和意義. 方法：通過(guò)阻斷7日齡新生Wistar大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈45 min制備腦缺血模型，設(shè)置假手術(shù)組、缺血再灌注組和預(yù)缺血缺血再灌注組. 采用免疫組化方法和計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)檢測(cè)三組新生鼠不同時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)腦組織GAP43的動(dòng)態(tài)變化及三組光鏡下腦組織病理改變. 結(jié)果： 腦組織病理改變：假手術(shù)組大鼠無(wú)異常病理改變，缺血再灌注組神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，預(yù)缺血組病理?yè)p

2、傷較缺血再灌注組輕. GAP43表達(dá)：缺血再灌注組海馬GAP43表達(dá)在再灌注后24 h時(shí)開(kāi)始增高，7 d達(dá)高峰，至14 d與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；預(yù)缺血缺血再灌注組GAP43表達(dá)較缺血再灌注組增加更明顯，與假手術(shù)組和缺血再灌注組比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）. 結(jié)論： 新生鼠腦缺血預(yù)處理可減輕再次嚴(yán)重腦缺血對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，腦缺血預(yù)處理后海馬CA1區(qū)GAP43表達(dá)和合成增加，GAP43表達(dá)增加可能與神經(jīng)元再生和軸突重塑有關(guān)，是腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性代償機(jī)制之一.【關(guān)鍵詞】 腦缺血;缺血預(yù)處理；生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43；海馬；Wistar大鼠；新生0引言神經(jīng)生

3、長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growthassociated protein43, GAP43)是一種神經(jīng)細(xì)胞膜上的特異性磷蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和損傷再生中，常能檢測(cè)到GAP43在mRNA和蛋白水平上的明顯升高，被認(rèn)為是神經(jīng)元發(fā)育和再生的一個(gè)內(nèi)在決定因子1，在神經(jīng)發(fā)育和再生過(guò)程中呈現(xiàn)高表達(dá)，能調(diào)節(jié)神經(jīng)元對(duì)軸突引導(dǎo)信號(hào)的反應(yīng)，在引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)軸突形成新的聯(lián)系上起關(guān)鍵作用，是神經(jīng)元發(fā)育和可塑性的分子標(biāo)志物2，GAP43基因敲除大鼠其神經(jīng)發(fā)育障礙3. 研究發(fā)現(xiàn)，一次短暫的腦缺血可明顯減輕再次嚴(yán)重缺血造成的神經(jīng)元損害，此現(xiàn)象稱腦缺血預(yù)處理或缺血耐受4，對(duì)防止器官因再次嚴(yán)重缺血造成的損傷有保護(hù)作用. 本研究我

4、們觀察了新生鼠腦缺血預(yù)處理對(duì)海馬CA1區(qū)GAP43表達(dá)的影響，探討GAP43在新生鼠腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞反應(yīng)性再生、結(jié)構(gòu)重建以修復(fù)損傷的作用.1材料和方法1.1材料生后7 d Wistar大鼠，體質(zhì)量1822 g，共90只，雌雄不拘，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、預(yù)缺血缺血再灌注組. 每只鼠用1000 U青霉素腹腔注射預(yù)防感染，用30 g/L戊巴比妥鈉按40 mg/kg腹腔注射麻醉. 抗GAP43抗體（濃縮型），購(gòu)自武漢博士德公司，兔抗鼠多克隆抗體，編號(hào)為BA0878.1.2方法1.2.1腦缺血模型的制作假手術(shù)組:分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，不阻斷血流；缺血再灌注組：阻斷右側(cè)頸總動(dòng)脈45 min再灌注；預(yù)

5、缺血缺血再灌注組：微小止血夾阻斷右側(cè)頸總動(dòng)脈8 min，恢復(fù)灌注24 h，再次阻斷同側(cè)頸總動(dòng)脈45 min. 三組均于術(shù)后3 h，12 h，24 h，3 d，7 d，14 d斷頭處死，取右側(cè)大腦半球用40 g/L多聚甲醛固定待測(cè)；6個(gè)時(shí)點(diǎn)，每個(gè)時(shí)點(diǎn)5只，每組30只，共90只. 判斷腦缺血模型成功標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈后2 h對(duì)側(cè)(左側(cè))肢體活動(dòng)障礙.1.2.2海馬切片的制備及GAP43的檢測(cè)(免疫組織化學(xué)Envision 二步法)取各實(shí)驗(yàn)組大鼠右側(cè)大腦半球用40 g/L多聚甲醛固定12 h，石蠟包埋，進(jìn)行海馬CA1區(qū)、皮層連續(xù)冠狀切片，片厚4 m. 切片常規(guī)脫蠟和水化，蒸餾水漂洗后置于PBS中

6、，用30 mL/L過(guò)氧化氫避光孵育20 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS漂洗5 min×3次，加20 L一抗，37孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次，加20 L相應(yīng)的EnvisionTM復(fù)合物，37孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次，DAB顯色，蒸餾水漂洗，封片. 以PBS代替一抗作陰性對(duì)照.1.2.3圖像分析用Mias992B圖像分析系統(tǒng)(四川大學(xué)圖象圖形研究所研制)測(cè)量切片海馬CA1區(qū)GAP43 A值，每只鼠3張切片，每張切片測(cè)2次，每次所測(cè)面積>50%海馬CA1區(qū)，取其平均值作為GAP43的A值； 同時(shí)測(cè)定同一張切片上胼胝體的光

7、密度值作為其背景值. 實(shí)測(cè)值減去背景值得矯正吸光度(CA)，用CA值進(jìn)行比較和分析，以避免染色過(guò)程中非特異性染色所造成的誤差.            【關(guān)鍵詞】腦缺血;缺血預(yù)處理；生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43；海馬；Wistar大鼠；新生Expression and significance of GAP43 in         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版

8、權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。1.2.4腦組織病理學(xué)檢查取相應(yīng)部位切片行HE染色，觀察其病理學(xué)改變.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析，并結(jié)合LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩均數(shù)比較；P<0.05為差異有顯著性.    2結(jié)果2.1病理學(xué)改變假手術(shù)組未見(jiàn)神經(jīng)元損傷，缺血灌注組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自缺血12 h開(kāi)始可見(jiàn)水腫、神經(jīng)細(xì)胞灶性液化性壞死及膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)，以第3日為最重；預(yù)缺血組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理改變較缺血灌

9、注組輕，可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞變性、水腫，少量細(xì)胞出現(xiàn)壞死(圖1).圖13 d海馬CA1區(qū)HE ×400略2.2三組新生Wistar大鼠海馬CA1區(qū)GAP43表達(dá)經(jīng)復(fù)染后GAP43陽(yáng)性染色呈棕黃色點(diǎn)狀或顆粒狀沉積，位于胞質(zhì)內(nèi)，陰性對(duì)照切片未見(jiàn)GAP43免疫反應(yīng)產(chǎn)物. 假手術(shù)組海馬CA1區(qū)可見(jiàn)GAP43表達(dá)，隨日齡增加免疫反應(yīng)產(chǎn)物CA值逐漸增高；缺血灌注組和預(yù)缺血組海馬CA1區(qū)GAP43在腦缺血再灌注1 d免疫活性增高，7 d達(dá)高峰，14 d時(shí)免疫活性仍高；腦缺血再灌注組和預(yù)缺血組24 h，3 d，7 d，14 d CA值高于假手術(shù)組，兩組CA值與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05

10、)，并且腦缺血再灌注組和預(yù)缺血組CA值相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1，圖2).表1大鼠海馬CA1區(qū)GAP43表達(dá)(略)圖27 d GAP43表達(dá)×400略3討論GAP43是近年來(lái)分離鑒定的一種Mr為24×103的鈣調(diào)蛋白結(jié)合的胞膜磷酸蛋白質(zhì)，廣泛存在于神經(jīng)組織的神經(jīng)元中，特別在生長(zhǎng)、分化、再生的軸突末端含量極高，主作用是啟動(dòng)生長(zhǎng)錐形成，并使其附著、延伸和抵抗回縮因素的影響，在引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)軸突形成新的聯(lián)系上起關(guān)鍵作用，是決定神經(jīng)發(fā)育、軸突再生、突觸重建的可塑性特異性標(biāo)志蛋白質(zhì)5. 在神經(jīng)元的發(fā)育和再生過(guò)程中, GAP43伴隨著軸突的生長(zhǎng)在神經(jīng)組織內(nèi)大量

11、合成6，其表達(dá)產(chǎn)物主位于軸突生長(zhǎng)錐質(zhì)膜面,該蛋白通過(guò)加速生長(zhǎng)錐基部胞質(zhì)膜的擴(kuò)展而促進(jìn)軸突生長(zhǎng)；對(duì)大鼠腦皮質(zhì)缺血后GAP43表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，在缺血區(qū)細(xì)胞死亡引起了周圍存活神經(jīng)元軸突末梢GAP43曾高表達(dá)7-8，腦損傷后GAP43不是無(wú)限量無(wú)限期的增加,它在損傷的早期即刺激強(qiáng)度較大時(shí)增加明顯,隨著損傷修復(fù)過(guò)程的發(fā)展，GAP43的量不斷減少,一旦代償?shù)耐挥|聯(lián)系重新建立完成，GAP43的量也降到了原來(lái)的基礎(chǔ)水平；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠腦缺血再灌注24 h后，在缺血組海馬CA1區(qū)GAP43表達(dá)逐漸增高，第7日達(dá)高峰，14 d與假手術(shù)組比較仍有顯著差異；而缺血預(yù)處理組GAP43表達(dá)較缺血再灌注組增加更明顯.

12、這說(shuō)明在缺血缺氧腦損傷后，神經(jīng)系統(tǒng)啟動(dòng)保護(hù)機(jī)制并修復(fù)受損的神經(jīng)元，通過(guò)GAP43的表達(dá)增加，促進(jìn)突觸的不斷生長(zhǎng)是神經(jīng)進(jìn)行修復(fù)的重方式之一. Kitagawa等9在沙土鼠腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究中觀察到短暫性腦缺血預(yù)處理具有神經(jīng)保護(hù)作用，首次提出腦缺血預(yù)處理的概念：即機(jī)體對(duì)短暫缺血的適應(yīng)性反應(yīng)，能增加神經(jīng)元對(duì)再次嚴(yán)重腦缺血的耐受性；隨后在臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)腦缺血預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用10. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示缺血預(yù)處理組腦組織病理?yè)p害較單純?nèi)毖俟嘧⒔M輕，腦缺血預(yù)處理能對(duì)防止再次嚴(yán)重的腦缺血損傷有較好的保護(hù)作用；而缺血預(yù)處理組海馬CA1區(qū)GAP43表達(dá)較缺血再灌注組增加更明顯，提示經(jīng)腦缺血預(yù)處理后反映神經(jīng)元

13、側(cè)支出芽和反應(yīng)性軸突再生更活躍，其神經(jīng)細(xì)胞GAP43表達(dá)增加是神經(jīng)系統(tǒng)受損后的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制之一.【參考文獻(xiàn)】1 Benowitz LI, Routtenberg A. GAP43: An intrinsic determinant of neuronal development and plasticityJ. Trends Neurosci, 1997, 20(2): 84-91.2 Miyake K, Yamaoto W, Tadokoro M, et al. Alterations in hippocampal GAP43, BDNF, and L1 fowllowing sustai

14、ned cerebral ischemiaJ. Brain Res, 2002, 935(12): 24-31.3 Maier DL, ManiS, Donovan SL, et al. Disrupted Cortical map and absence of cortical barrels in growthassociated protein (GAP)43 knockout miceJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96(16): 9397-9462.4 Ran R, Xu H, Lu A, et al. Hypoxia preconditioning

15、 in the brainJ. Dev Neurosci, 2005,27(24):87-92.5 Dani JW, Armstrong DM, Benowitz LI. Mapping the development of the rat brain by GAP43 ImmunocytochemistryJ. Neuroscience, 1991, 40(1): 277-287.6 Stroemer RP, Kent TA, Hulsebosch CE. Neocortical neural sprouting, synaptogenesis, and behavioral recover

16、y after neocortical infarction in ratsJ. Stroke, 1995,26(11):2135-2144.7 Luque JM, Puig N, Martinez JM, et al. Glutamate NmethylDaspartate receptor blockade prevents induction of GAP43 after focal ischemia in ratsJ. Neurosci Lett, 2001, 305(2): 87-90.8 Zhang Y, Bo X, Schoepfer R, et al. Growthassociated protein GAP43 and L1 act synergistically to promote regenerative growth of Purkinje cell axons in vivoJ. Proc Natl Acad Sci USA， 2005, 102(41):14883-14888.9 Kitagawa K， Matsumoto M，Tagaya M, et al. “Ischemic tolerance” phenomenon found in the brainJ. Brain Res， 1990, 528(1): 21-24.1