淺論腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle CMV- +VEGF121-IRES-hrGFP-1的構(gòu)建和鑒定

1、淺論腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle CMV- +VEGF121-IRES-hrGFP-1的構(gòu)建和鑒定 【摘要】 目的 構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle CMV-+VEGF121-IRES-hrGFP-1，為構(gòu)建表達(dá)具有抗原表位標(biāo)記的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子121(vascular endothelial growth factor 121,VEGF121)，并同時(shí)表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)報(bào)告分子的腺病毒真核細(xì)胞表達(dá)載體打下基礎(chǔ)。方法 對(duì)目的基因供體質(zhì)粒pTG19T-VEGF121攜帶的VEGF121基因測(cè)序和序列內(nèi)部存在的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行

2、分析，利用PCR(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)對(duì)pTG19T-VEGF121攜帶的VEGF121基因突變，以去除翻譯終止密碼子后的基因序列并在序列前后分別添加新的NotI和XhoI酶切位點(diǎn)。將突變后的VEGF121基因(+VEGF121)定向連入腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1，通過(guò)電泳和測(cè)序鑒定獲得的重組質(zhì)粒。結(jié)果 重組質(zhì)粒經(jīng)電泳和測(cè)序鑒定為正確克隆。結(jié)論 成功構(gòu)建了pShuttle CMV- +VEGF121-IRES-hrGFP-1。 【關(guān)鍵詞】 腺病毒穿梭載體;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子121 Abstract: Objecti

3、ve To clone vascular endothelial growth factor 121 (VEGF121) gene into the adenovirus shuttle plasmid pShuttleCMV-IRES-hrGFP-1, preparing for construction of a novel recombinant adenovirus vector expressing the VEGF121 fused to FLAG epitope and humanized Renilla reniformis green fluorescent protein

4、1(hrGFP-1) as a reporter on the same transcript. Methods The VEGF121 gene contained in the plasimid of pTG19T-VEGF121 was sequenced, and the profile of restriction endonuclease sits existing in the sequence was analysed. Then the translation stop codon TAG was removed. Meanwhile, NotI and Xho I rest

5、riction sites were added before the start codon and after the 3end of the mutant through polymeras chain reaction (PCR) mutagenesis technology. The mutant of VEGF121 gene(+VEGF121 gene) was ligated into the multiple cloning sites of the adenovirus shuttle plasmid pShuttle CMV-IRES-hrGFP一1by the dire

6、ctional cloning method. To identify the correct recombinants the analysis of sequencing and electrophoresis was adopted. Results The electrophoresis and sequencing map of the recombinant accorded with theoretic analyses of pShuttle CMV-+ VEGF121-IRES-hrGFP-1. Conclusions The adenovirus shuttle plasm

7、id pShuttle CMV- VEGF121-IRES-hrGFP-1 has been constructed successfully.Key words:adenovirus shuttle plasmid; vascular endothelial growth factor 121(VEGF121)在骨組織的胚胎發(fā)生或骨損傷愈合的過(guò)程中，缺乏良好的血供將導(dǎo)致骨生長(zhǎng)異常和骨愈合不良。臨床植骨修復(fù)缺損時(shí)，要求植骨床具有豐富的血供，而自體骨移植時(shí)，也常通過(guò)帶血管蒂或帶肌瓣增強(qiáng)血供，促進(jìn)移植骨早期成活。因此，一個(gè)較為完善的血管網(wǎng)對(duì)于骨形成是非常必要的，它不僅能提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，還能輸送成骨

8、前體細(xì)胞，分泌成骨細(xì)胞所需的生長(zhǎng)因子1。在眾多已發(fā)現(xiàn)的誘血管生成的因子中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)被公認(rèn)為是作用最強(qiáng)，特異性最高的一種，這個(gè)細(xì)胞因子本身也和骨形成有著直接密切的關(guān)系3-5，在各類成骨的活動(dòng)中起著積極的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子在體內(nèi)通過(guò)選擇性剪切mRNA編碼序列可產(chǎn)生六種不同的異構(gòu)體，其中其中以VEGF165和VEGF121的作用最為顯著，但由于VEGF165以一半可溶性，一半不可溶性蛋白在機(jī)體內(nèi)表達(dá)，可分泌到細(xì)胞外，但一部分與細(xì)胞膜或細(xì)胞間質(zhì)結(jié)合，而VEGF121則全部為可溶性，不結(jié)合于肝素的弱酸性蛋白質(zhì)，完全分泌到胞外并游離于細(xì)胞間質(zhì)，可以更好的發(fā)揮旁分泌的作用，促

9、進(jìn)血管生成。本實(shí)驗(yàn)利用hrGFP-1為報(bào)告基因，構(gòu)建含VEGF121和hrGFP-1基因的穿梭載體，為進(jìn)一步研究VEGF121在體內(nèi)的表達(dá)和促血管生成及成骨的活動(dòng)打下基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 質(zhì)粒和菌株 pTG19T-VEGF121質(zhì)粒購(gòu)自上海東方肝膽外科研究所;腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1購(gòu)自Stra-tagene公司;pMD19-T和大腸桿菌感受態(tài)DH5購(gòu)自TaKaRa公司。1.1.2 主要試劑、試劑盒 各種限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit Ver.2.0、高保真DNA聚合酶、Agarose Gel DNA Purific

10、ation Kit Ver.2.0、TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0 質(zhì)粒小量提取試劑盒、dNTP、DL15000等購(gòu)自TaKaRa公司。1.2 方法1.2.1 VEGF121基因的突變及攜帶突變后VEGF121基因(記作 +VEGF121)的pMD19-T質(zhì)粒的亞克隆：以pTG19T-VEGF121為模板利用PCR技術(shù)突變VEGF121基因以去除VEGF121基因中終止密碼子TAG序列，之后在基因序列前后分別加入NotI和XhoI酶切位點(diǎn)：引物序列F:5-GCGGCCGCATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3R:5-CTCGAGC

11、CGCCTCGGCTTGTCACATT-3以pTG19T-VEGF121為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：98 ，10 s,30 cycles;55 ,5 s,3030 cycles;72 ,30 s,30 cycles;72 ,5 min,1 cycles，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR產(chǎn)物加“A”和純化：切膠回收PCR產(chǎn)物，然后進(jìn)行加“A”反應(yīng)，然后使用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0進(jìn)行精制。連接,轉(zhuǎn)化,篩選陽(yáng)性克隆:使用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.0中的Solution I將PCR產(chǎn)物與pMD19-T質(zhì)

12、粒連接。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂平板，37 過(guò)夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒及測(cè)序。 1.2.2 穿梭質(zhì)粒pShuttle CMV- +VEGF121-IRES-hrGFP-1的構(gòu)建及鑒定質(zhì)粒pMD19-T-+VEGF121和穿梭載體pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1分別進(jìn)行NotI和XhoI雙酶切。pMD19-T-+VEGF121反應(yīng)條件：pMD19-T-VEGF121(約200 ng/L)5 L 10H Buffer 5 L 0.1%BSA 5 L Not I(10 U/L) 1.5 L Xho I(10 U/L) 1.5 L dHO Up to 50 L 37 4 hours。pShuttl

13、eCMV -IRES-hrGFP-1反應(yīng)條件pShuttle-IRES-hrGFP-1(約50 ng/L) 20L 10H Buffer 5 L 0.1%BSA 5 L Not I(10 U/L) 1.5L Xho I(10 U/L) 1.5 L dH2O Up to 50 L 37 16 hours瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收后,按摩爾比101混合，加入T4 DNA Ligase 和buffer,16過(guò)夜反應(yīng)，次日轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌DH5,涂布平板，37 過(guò)夜培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性克隆。經(jīng)測(cè)序鑒定目的基因以正確的閱讀框插入穿梭載體。2 結(jié) 果2.1 穿梭質(zhì)粒pShuttle CMV-+VEGF121-IR

14、ES-hrGFP-1的電泳結(jié)果：可見(jiàn)介于7500bp和10000bp的 pShuttle CMV- +VEGF121-IRES-hrGFP-1條帶。2.2 pShuttle CMV- +VEGF121-IRES-hrGFP-1測(cè)序結(jié)果3 討 論pShuttleCMV-IRES-hrGFP-1是美國(guó)Stratagene公司開(kāi)發(fā)的一種新型腺病毒穿梭質(zhì)粒，具有CMV啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和PolyA信號(hào)區(qū)等真核基因表達(dá)所必需的順調(diào)控元件和同源重組序列 并且在多克隆位點(diǎn)后依移計(jì)安排了FIAG抗原表位(FLAG epitope，F(xiàn)LAG為人工合成抗原表位， 其氨基酸殘基序列DYKDDDDK)基因、內(nèi)部核糖體

15、進(jìn)人位點(diǎn)(internal ribosome entry site IREs)和hrGFP-1基因。由于IRES的存在，使插人多克隆位點(diǎn)的目能與GFP基因以雙順?lè)醋拥男问酵瑫r(shí)表達(dá)。雙因表達(dá)載體是載體構(gòu)建新的發(fā)展方向，以雙順?lè)醋有问奖磉_(dá)hrGFP-1報(bào)告基因和VEGF121目的基因，能夠?qū)EGF121進(jìn)行抗原表位標(biāo)記的腺病毒表達(dá)載體可極大的方便VEGF121蛋白表達(dá)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR技術(shù)突變?nèi)TG19T-VEGF121所攜帶的VEGF121基因序列中翻譯終止密碼子后的堿基序列，在其前后分別添加NotI和XhoI酶切位點(diǎn)。使基因能夠定向連接于pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1

16、多克隆位點(diǎn)中的NotI和XhoI之間。去除翻譯終止密碼子之后堿基的VEGF121基因序列從翻譯起始密碼子到FLAG抗原表位基因的堿基序列不會(huì)導(dǎo)致FLAG抗原表位基因的框移突變，而且由于去除了VEGF121基因的終止密碼子，導(dǎo)致兩個(gè)基因的通讀，使兩種蛋白融合表達(dá)。對(duì)后續(xù)的VEGF121蛋白表達(dá)的特異性檢測(cè)提供了方便?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Peng H,Wright V,Usas A,et al.Synergistic enhancement of bone formation and healing by stem cell expressed VEGF and bone morphogenetic

17、 proteinJ. Clin Invest，2002，110：751-759. Dvorak H,BrownLF,Delmar M.Vascular Permeability factor/vascular endothelial growth factor micro vascular hyperpermeability，and angiogenesisJ.AM/Pathol,1995,146：1029-1039. Mayr-wohlfart U,Waltenberger J,Housser H,et al.Vascular endothelial growth factor stimulates chemotactic migration of primary human osteoblasts J.Bone,2002,30(3)：472-477. Niida S,Kaku M,Amano H,et a1.Vascular endothelial factor can substitute for macrophage colony stimulating factor in the support of esteodastic bone resorptionJ. Exp Med，1999，190(2)：293-298. Engaig M T,Chen O J,Vu T H