RhoARho激酶信號(hào)通路在血管緊張素Ⅱ刺激心肌成 纖維細(xì)胞

1、    作者：汪祥海， 伍衛(wèi)， 楊軍， 方昶， 耿登峰， 黃至斌【摘要】  【目的】 探討RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在血管緊張素（angiotensin，Ang）刺激心肌成纖維細(xì)胞（ cardiac fibroblasts，CFBs）增殖和膠原合成中的作用。【方法】 采用胰酶消化、差速貼壁法培養(yǎng)新生SD 大鼠CFBs,并用Ang誘導(dǎo)CFBs增殖和膠原合成。采用四氮唑鹽比色法測(cè)定細(xì)胞增殖,羥脯氨酸法測(cè)定CFBs膠原含量,RT-PCR檢測(cè)RhoA/Rho激酶mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)肌球蛋白結(jié)合亞基磷酸化（phosph

2、orylation of myosin-binding subunit,MBS-P）表達(dá)作為Rho激酶功能活化的標(biāo)志。【結(jié)果】 Ang(10-7mol/L )刺激48 h可誘導(dǎo)新生SD大鼠CFBs的Rho激酶活化（< 0.01），上調(diào)RhoA、Rho激酶mRNA表達(dá)(0.05），但可抑制Ang誘導(dǎo)的MBS-P蛋白表達(dá)。可見(jiàn)，Ang可誘導(dǎo)Rho激酶活化， H4413對(duì)Ang誘導(dǎo)的Rho激酶活化具有抑制作用。    2 4   Ang對(duì)鼠心肌CFBs增殖和膠原合成的影響及H4413干預(yù)    方差分析結(jié)果示Ang與H4413對(duì)SD大

3、鼠CFBs的CFBs增殖和膠原合成有交互效應(yīng)（F=5.24和6.41）, 10-7 mol/L Ang刺激大鼠心肌成纖維細(xì)胞48 h后, MTT (A490值)和膠原合成量均顯著增高（F=7.38和8.51），10-5 mol/L H4413預(yù)處理對(duì)A490值和膠原合成量無(wú)顯著影響（F=0.046和1.27），但可抑制Ang的作用(表2)。    3   討   論    心肌成纖維細(xì)胞（CFBs）增殖和膠原合成在心肌纖維化中起重要作用，心肌纖維化又是心功能由代償向失代償期轉(zhuǎn)變的重要病理過(guò)程3。

4、Ang是促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞（CFBs）增殖、膠原合成的一個(gè)重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，10-7mol/L Ang具有促進(jìn)CFBs增殖活力和膠原合成作用，這與國(guó)內(nèi)外許多作者的研究相一致4，5。但Ang刺激CFBs增殖和膠原合成受體后的確切的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制目前尚未完全清楚。    小分子Rho GTP 酶家族具有廣泛的生物學(xué)功能,除了對(duì)細(xì)胞骨架重排有重要調(diào)控作用外,亦參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的局部黏附、遷移、聚集、增殖和基因轉(zhuǎn)錄等1，6。新近有研究發(fā)現(xiàn)，Rho 激酶可能參與調(diào)控Ang誘導(dǎo)心肌肥厚和血管平滑肌肥大7,另有文獻(xiàn)報(bào)道 RhoARho 激酶通路與SHR大鼠心血管重構(gòu)及小鼠心肌梗死后左室

5、重構(gòu)有關(guān)，長(zhǎng)期抑制Rho 激酶可顯著改善心血管重構(gòu)2,8。    本研究在培養(yǎng)的新生SD大鼠CFBs上觀察到，Ang（10-7 mol/L）在刺激CFBs增殖、膠原合成的同時(shí)可激活Rho 激酶，并明顯上調(diào)CFBs的RhoA和Rho 激酶mRNA的表達(dá)水平，提示在Ang刺激CFBs增殖和膠原合成中RhoARho 激酶信號(hào)通路被活化。Hydroxyfasudil（H4413）是RhoARho 激酶信號(hào)通路高度特異性的抑制劑,常應(yīng)用于該信號(hào)通路的功能研究9,我們用H4413 10-5 mol/L預(yù)處理CFBs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， H4413與Ang對(duì)大鼠CFBs的Rho激酶活化和RhoA

6、、Rho激酶mRNA表達(dá)有交互效應(yīng), 10-5 mol/L H4413可顯著抑制10-7 mol/L Ang刺激的CFBs增殖與膠原合成。從上述結(jié)果我們可以推論出，Ang刺激CFBs增殖和膠原合成至少部分是通過(guò)RhoARho 激酶信號(hào)通路所介導(dǎo)。    RhoARho 激酶通路可能并非Ang誘導(dǎo)CFBs增殖、膠原合成唯一的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有學(xué)者報(bào)道，Ang可通過(guò)結(jié)合AT1受體,以酪氨酸激酶途徑激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)引起心肌纖維化9；另有文獻(xiàn)報(bào)道，Ang可通過(guò)增加心肌成纖維細(xì)胞MAPK活性和DNA合成刺激轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1 mRNA表達(dá)和蛋白合成的增加，進(jìn)而引起心肌纖

7、維化10。在調(diào)控Ang刺激的CFBs增殖和膠原合成中，RhoARho 激酶通路與ERK、MAPK間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系有待進(jìn)一步明確。    Rho 激酶有兩種同源性極高的異構(gòu)體形式 (ROCK/ ROCK 2 和ROCK/ ROCK 1)，新近，利用基因敲除技術(shù)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ROCK1在壓力負(fù)荷致心肌間質(zhì)纖維化中起重要作用11。在調(diào)控Ang刺激的CFBs的增殖和膠原合成中，何種Rho 激酶亞型起主要作用，亦有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  BURRIDGE K, WENNERBERG K. Rho and Rac take center stageJ. Cell

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