鼠抗人TCRCD3單克隆抗體的制備及其初步應(yīng)用

1、鼠抗人TCR/CD3單克隆抗體的制備及其初步應(yīng)用     作者：陳宏遠(yuǎn),芮雯,花文峰，杜軍,蔡紹暉 【摘要】  目的 應(yīng)用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，制備鼠抗人CD3 單克隆抗體，并用于T淋巴細(xì)胞亞類檢測(cè)。方法 以本室純化的CD3蛋白免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，成功地獲得1株抗人CD3單克隆抗體。經(jīng)間接ELISA測(cè)定，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)腹水的抗體效價(jià)。結(jié)合SDS?PAGE實(shí)驗(yàn)考察單克隆抗體對(duì)CD3促T淋巴細(xì)胞增殖活性的作用。結(jié)果雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)腹水的抗體含量為20 mg/mL，效價(jià)為10-7，并對(duì)T淋巴細(xì)胞有

2、促增殖活性，檢測(cè)正常人外周血陽(yáng)性T細(xì)胞百分率為(73±7)。結(jié)論制備的抗人CD3單克隆抗體具備較高的純度和活性，可用于T細(xì)胞亞類的檢測(cè)。 【關(guān)鍵詞】  CD3；單克隆抗體；雜交瘤     Abstract: Objective To detect the CD3 positive T lymphocytes subgroup with the monoclonal antibody of mouse anti?human CD3 antigen of T lymphocyte which produced by B lymphocyte hyb

3、ridoma technique. Methods Balb/c mice were immunized with CD3 protein produced in our laboratory, mixed SP2/0 myeloma with spleen cells of the mice, then obtained an anti?human CD3 antigen of hybridoma cell line. The ascitic culture monoclonal antibody titer was determined by indirect?ELISA, the qua

4、ntity and molecular weight were determined by SDS?PAGE. MTT method was contributed to explore its activity of promoting T lymphocyte proliferation. Results The monoclonal antibody quantity of ascitic hybridoma cell was 20 mg/mL and the titer was 10-7. It had an activity of promoting T lymphocyte pro

5、liferation, percentage of T lymphocyte in healthy adult peripheral blood samples was (73±7).Conclusion This results suggest that the anti?CD3 monoclonal antibody had high purity and activity that might be used in the detection of  CD3  positive T lymphocytes subgroup, and could be app

6、lied in T lymphocyte detection.     Key words: CD3;monoclonal antibody; hybridomas    CD3是T淋巴細(xì)胞的一個(gè)分化抗原，表達(dá)于所有成熟T細(xì)胞表面，它是由5條肽鏈非共價(jià)結(jié)合組成的復(fù)合分子，分別稱為、和鏈。其與TCR分子以非共價(jià)結(jié)合形成一個(gè)TCR/CD3復(fù)合受體分子，其中TCR是識(shí)別異種抗原和自身MHC分子多態(tài)性決定族的受體，而CD3分子并不參與抗原識(shí)別，它具有穩(wěn)定TCR結(jié)構(gòu)和傳遞活化信號(hào)的作用。TCR/CD3復(fù)合體是T細(xì)胞功能和特異性的主要調(diào)節(jié)者，抗TCR/CD

7、3 單克隆抗體已在基礎(chǔ)研究和臨床中都被廣泛應(yīng)用。如何制備質(zhì)量好、產(chǎn)量高的單克隆抗體是當(dāng)前各有關(guān)實(shí)驗(yàn)室研究的重要問題。目前用于生產(chǎn)單克隆抗體的方法有2種：利用純系小鼠生產(chǎn)免疫腹水法和雜交瘤細(xì)胞常規(guī)體外培養(yǎng)法1,2。鑒于本次試驗(yàn)樣品備用于后續(xù)的研發(fā)，以及腹水法易保持生物學(xué)活性、耗時(shí)短和易操作等優(yōu)點(diǎn)，故應(yīng)用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)聯(lián)合腹水法，制備并篩選了1株抗人CD3 單克隆抗體，并對(duì)其特性進(jìn)行了鑒定和檢測(cè)，獲得較為滿意的結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。     1  材料與方法     1.1  材料    

8、; 1.1.1  純化抗原、抗體與試劑/盒  CD3抗原利用基因重組技術(shù)制備，由本室純化并提供。鼠抗人CD3 單克隆抗體及羊抗鼠IgG抗體,APAAP  Kit 為Sigma 公司產(chǎn)品，50()聚乙二醇（PEG,MW1500）等其余細(xì)胞融合、免疫檢測(cè)、分離純化和SDS?PAGE電泳試劑，均為進(jìn)口或進(jìn)口分裝分析純產(chǎn)品。     1.1.2  細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)液  小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0細(xì)胞系）由中山大學(xué)藥學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，7周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：粵監(jiān)證字2004A

9、084；完全RPMI1640培養(yǎng)液（含10新生小牛血清）、無血清RPMI1640培養(yǎng)液、HAT培養(yǎng)液和HT培養(yǎng)液由Gibico公司提供。     1.2  方 法     1.2.1  免疫小鼠和骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備  將CD3純品的蛋白濃度調(diào)整為1 mg/mL, 取0.4 mL與等量的福氏完全佐劑混合、乳化,注射于Balb/C小鼠腹腔，每只小鼠0.2 mL。2周后，同樣劑量的CD3與等量的福氏不完全佐劑混合、乳化, 加強(qiáng)免疫。 融合前3 d，尾靜脈注射100 g CD3蛋白。將小鼠骨髓瘤細(xì)胞用完全RPMI16

10、40培養(yǎng)液在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。選擇生長(zhǎng)旺盛、活力大于95的骨髓瘤細(xì)胞，收集于50 mL離心管中，1 000 r/min離心15 min。棄上清液，沉淀細(xì)胞用無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗滌2次，1 000 r/min離心15 min。用無血清RPMI1640培養(yǎng)液重懸末次沉淀細(xì)胞，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，配成1×106細(xì)胞/mL，以備融合使用。     1.2.2  免疫小鼠脾細(xì)胞懸液的制備  無菌條件下取免疫小鼠脾臟，置培養(yǎng)皿中的200目不銹鋼網(wǎng)上。加少量無血清RPMI1640培養(yǎng)液，用注射器平端將脾臟輕輕壓過鋼網(wǎng)，取出鋼網(wǎng)，用滴管輕輕吹吸

11、分散細(xì)胞。再以RPMI1640培養(yǎng)液洗滌一次，1 000 r/min離心10 min。沉淀細(xì)胞重懸于50 mL無血清RPMI1640培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞，以備融合使用。     1.2.3  細(xì)胞融合  取制備好的骨髓瘤細(xì)胞與脾淋巴細(xì)胞，以18比例在50 mL離心管中混合，1 000 r/min離心10 min。棄盡上清，輕輕叩松留存管內(nèi)的沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞、50PEG及無血清RPMI1640培養(yǎng)液均置于37 水浴箱中預(yù)溫。將50PEG 0.8 mL于1 min內(nèi)逐滴加入細(xì)胞沉淀中，37 水浴箱中靜置1 min。逐漸加入預(yù)溫的無血清RPMI164

12、0培養(yǎng)液30 mL,輕輕搖動(dòng)試管，5 min內(nèi)加完。在室溫中以1 000 r/min離心10 min。棄上清，沉淀細(xì)胞用10 mL含小牛血清的HAT培養(yǎng)液重新懸浮。滴加于預(yù)先鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔100 L。置37 、5CO2孵箱培養(yǎng)。     1.2.4  雜交瘤細(xì)胞的克隆化  采用有限稀釋法。于96孔平底微量培養(yǎng)板制備巨噬細(xì)胞培養(yǎng)層3，用一塊板作陽(yáng)性孔雜交瘤細(xì)胞的克隆化。收集并計(jì)數(shù)各陽(yáng)性孔中的細(xì)胞。分別制備細(xì)胞數(shù)目為20、10、5 /mL的細(xì)胞懸液。分別加入96孔培養(yǎng)板，每孔100 L。培養(yǎng)板置37 、5CO2孵箱培養(yǎng)。12周可

13、觀察到克隆生長(zhǎng)。檢測(cè)上清中的抗體，將陽(yáng)性孔中雜交瘤細(xì)胞再次選出培養(yǎng)并作克隆化。    1.2.5  雜交瘤細(xì)胞系的建立與維持  每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.5 mL降植烷。7 d后于小鼠腹腔內(nèi)注射1×106雜交瘤細(xì)胞，2周后大多數(shù)可產(chǎn)生實(shí)體瘤和腹水。用注射器抽出腹水，在4 以2 000 r/min離心15 min，備用腹水凍存于-70 。小鼠存活期間可重復(fù)上述最后一步。     1.2.6  單克隆抗體的提取與純化4  取上述收獲的腹水加等量PBS，于攪拌下逐滴加入等體積的飽和硫酸

14、銨。 冰浴30 min，2 500 r/min,30 min，使其充分沉淀。將所得沉淀物以1 mL PBS溶解至裝入透析袋。對(duì)PBS充分透析、除鹽換液3次，至萘氏試劑測(cè)透析外液為無黃色。將透析袋內(nèi)樣品取少許作適當(dāng)倍數(shù)稀釋后，以紫外分光度計(jì)測(cè)蛋白含量。單克隆抗體的進(jìn)一步純化按照Protein A Agrose說明書進(jìn)行。SDS?PAGE （10的分離膠和5的濃縮膠）結(jié)合分光光度計(jì)檢測(cè)樣品濃度。間接ELISA法檢測(cè)收集腹水的效價(jià)。     1.2.7  純化抗CD3 單克隆抗體刺激T細(xì)胞活化的活性檢測(cè)  采用MTT法。采集肝素抗凝的正常人靜脈血,

15、以Ficoll?Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞, 再以尼龍毛柱法分離純化T細(xì)胞。取100 L(1×109細(xì)胞/L ), 用流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞的純度，其余用于刺激T細(xì)胞活化的活性分析。96孔板上用羊抗鼠IgG包被（50倍稀釋，加50 L/孔）：加入50倍PBS稀釋羊抗鼠IgG 50 L/孔，4 過夜。棄上清。加入1BSA（PBS稀釋）100 L，37，3 h，棄上清用PBS洗2次。4 保存。RPMI1640培養(yǎng)液稀釋純化的單克隆抗體（設(shè)110、1100、1500三個(gè)稀釋度），每孔100 L，以培養(yǎng)基為對(duì)照組，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，向各孔中分別加入100 L的T淋巴細(xì)胞懸液（2

16、×104），37 、5%CO2培養(yǎng)。72 h后，取培養(yǎng)板每孔加MTT液20 L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，2 500 r/min離心10 min，棄上清培養(yǎng)液，每孔加Formazan裂解液100 L，待其沉淀溶解，在測(cè)定波長(zhǎng)570 nm，參比波長(zhǎng)630 nm下測(cè)定吸光度。     1.2.8  堿性磷酸酶?抗堿性磷酸(APAAP)橋聯(lián)酶標(biāo)法測(cè)定T細(xì)胞亞群5,6  常規(guī)法Ficoll?Hypaque密度分離法，分離健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞，洗滌后用含10()FCS的PMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度至 1×10mL。橋聯(lián)酶標(biāo)法操作安裝說明書進(jìn)行：

17、取100 L細(xì)胞懸液滴加在干凈載玻片上，風(fēng)干，用純丙酮固定。PBS洗3次，每次2 min,干燥，用蠟筆畫圈標(biāo)記細(xì)胞所在位置。加一抗（自制鼠抗人單克隆抗體）10 L，37 濕盒孵育30 min; PBS浸洗5 min，擦片。加二抗150羊抗鼠IgG 10 L，37 濕盒孵育30 min; PBS浸洗5 min，擦片。加堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶(12 000)復(fù)合物10 L。37濕盒孵育30 min; PBS浸洗5 min，擦片。加堿性磷酸酶底物10 L，37 濕盒孵育30 min; PBS浸洗5 min，擦片。Mayer蘇木精復(fù)染1 min，自來水下沖洗,鏡檢。   

18、0; 2  結(jié)果與分析     2.1  單克隆抗體的制備     應(yīng)用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，進(jìn)行4次細(xì)胞融合，平均融合率約 95%。將所得陽(yáng)性克隆孔進(jìn)行有限稀釋克隆化45次，直到亞克隆的陽(yáng)性率均達(dá)到100%。最后獲得1株雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)體外連續(xù)培養(yǎng)半年及液氮反復(fù)凍融多次，分泌抗體水平未見下降。說明已是穩(wěn)定分泌鼠抗人CD3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。     2.2  單克隆抗體含量測(cè)定     將雜交瘤細(xì)胞的腹水和精制單克隆抗體10 L進(jìn)行SDS?

19、PAGE（如圖1），可見重鏈和輕鏈的分子量分別為55和25 kD的條帶。用先鹽析后透析，然后再用Protein A Agrose純化，單克隆抗體濃度為20 mg/mL; 所得純品經(jīng)10倍逐級(jí)稀釋，用間接ELISA法檢測(cè)腹水的效價(jià)為1×10-7。     2.3  抗CD3單克隆抗體刺激T細(xì)胞活化的活性分析     以Ficoll?Hypaque 密度梯度離心法分離 PBMC, 再通過尼龍毛柱法純化 T細(xì)胞， 用 FITC標(biāo)記的抗 CD3 單克隆抗體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果表明, T細(xì)胞的純度為 86.9 %。用純化

20、的單克隆抗體刺激純化的T細(xì)胞, 同時(shí)設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照, 作用72 h后， 加入 MTT液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞, 測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比, 抗 CD3 單克隆抗體具有明顯的 T細(xì)胞刺激活性。     24  橋聯(lián)酶標(biāo)法測(cè)定T細(xì)胞亞群     通過對(duì)空白對(duì)照和試驗(yàn)組玻片的顯微鏡鏡下觀察，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，可計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞率。鏡下可見（如圖2）陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞膜上或胞質(zhì)著色為紅色，胞核為藍(lán)色（箭頭1所示）。陰性細(xì)胞細(xì)胞膜上或胞質(zhì)著色為無色，胞核為藍(lán)色（箭頭2所示）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出CD3陽(yáng)性T細(xì)胞百分率(n=20，

21、7;s)為（73±7）。     3  討 論     自第一個(gè)T細(xì)胞CD3分子特異性的單克隆抗體 OKT3在首屆國(guó)際白細(xì)胞分化抗原會(huì)議上得到公認(rèn)以來，目前許多實(shí)驗(yàn)室已生產(chǎn)出眾多抗TCR/CD3復(fù)合體分子的單克隆抗體，不同的單克隆抗體在親和力、免疫球蛋白類和亞類及其特異性上不盡相同。     本研究以基因重組表達(dá)CD3為免疫原，加佐劑進(jìn)行基礎(chǔ)免疫后，經(jīng)融合、篩選及克隆化，得到1株分泌抗CD3 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。取之連續(xù)3次克隆化后達(dá)100陽(yáng)性。用此雜交瘤細(xì)胞制備的腹水效價(jià)為 10

22、-7。該細(xì)胞株經(jīng)體外連續(xù)培養(yǎng)半年及液氮反復(fù)凍融多次，其分泌單克隆抗體的能力不變,表明上述方法免疫成功。為了獲得高純度的單克隆抗體，采用了鹽析和透析相結(jié)合的方法?？紤]到蛋白質(zhì)濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低，但雜蛋白的共沉作用也隨之增加，從而影響蛋白質(zhì)的純化。故將腹水以PBS作等倍稀釋后再鹽析。離子強(qiáng)度也可影響蛋白質(zhì)沉淀，當(dāng)硫酸銨飽和度為33時(shí)球蛋白析出。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)蛋白沉淀后宜在4過夜，更易于形成較大沉淀而易于分離?？?CD3 單克隆抗體蛋白的檢測(cè)采用Western blot法7。取抗CD3 單克隆抗體進(jìn)行SDS?PAGE，再用 Bio?Rad公司的蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上,以HRP?mMcAb?CD3進(jìn)行檢測(cè), 經(jīng)相應(yīng)試劑盒鑒定本單克隆抗體的重鏈為小鼠IgG2a亞類，輕鏈為型。T細(xì)胞是由一群功能不同的異質(zhì)性淋巴細(xì)胞組成8，由于它在胸腺內(nèi)分化成熟故稱為T細(xì)胞。成熟T細(xì)胞由胸腺遷出，移居于周圍淋巴組織中淋巴節(jié)的副皮質(zhì)區(qū)和脾白髓小動(dòng)脈的周圍。不同