重疊PCR克隆Exendin—4的基因及序列分析

1、重疊PCR克隆Exendin4的基因及序列分析    摘要 目的 克隆Exendin-4 39肽氨基酸序列基因編碼區(qū)cDNA。 方法 根據(jù)Exendin-4氨基酸序列編碼cDNA，設(shè)計(jì)正、負(fù)向引物/模板鏈，利用重疊延伸PCR法擴(kuò)增出Exendin-4編碼區(qū)基因DNA片段；將獲得的基因片段插入pGEM-T-Easy質(zhì)粒中；轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5后挑選陽(yáng)性克隆，利用限制性內(nèi)切酶及核苷酸序列分析技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒。 結(jié)果 經(jīng)質(zhì)粒DNA酶切分析及序列測(cè)定，獲得了Exendin-4 DNA片段序列。 結(jié)論 本研究成功克隆了Exendin-4 cDNA，為下一步構(gòu)建Ex

2、endin-4真核表達(dá)載體打下基礎(chǔ)，也為Exendin-4基因治療糖尿病提供了前提條件。 關(guān)鍵詞 Exendin-4；重疊延伸PCR；基因克隆 中圖分類號(hào) Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1673-7210（2013）05（c）-0013-03 Exendin-4是胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體長(zhǎng)效激動(dòng)劑，具有與GLP-1相似的降血糖活性，目前已研發(fā)成為首個(gè)“模仿腸降血糖素”治療2型糖尿病的藥物Exenatide1-2。但是Exenatide需每日注射，對(duì)糖尿病患者的治療很不方便3，并且天然Exendin-4的提取成本高，難以滿足臨床應(yīng)用需要4，用基因工程方法生產(chǎn)前景廣闊。由于Exen

3、din-4缺乏模板，本實(shí)驗(yàn)利用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增出Exendin-4目的基因編碼區(qū)DNA片段，成功構(gòu)建了Exendin-4表達(dá)載體，為進(jìn)一步利用腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建表達(dá)Exendin-4及研究其在糖尿病治療過(guò)程中的分子作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 質(zhì)粒與菌株 克隆載體pGEM-T-Easy質(zhì)粒（50 ng/L）購(gòu)自Promega公司；大腸桿菌TOP10、E. coli DH5菌株由西安華廣生物工程公司提供。 1.2 工具酶和主要試劑 限制性內(nèi)切酶Nae、BamH、EcoR及TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶等試劑購(gòu)自華美生物工程公司；質(zhì)粒小提試劑盒、PCR純化試劑盒、DN

4、A回收試劑、Marker等均購(gòu)自北京天根公司；引物合成及測(cè)序由上海生物工程有限公司完成；其他試劑及全部實(shí)驗(yàn)設(shè)備均由西安華廣生物工程公司提供。 1.3 方法 1.3.1 重疊延伸PCR擴(kuò)增Exendin-4 cDNA3 根據(jù)美國(guó)專利檢索到Exendin-4 氨基酸序列是39個(gè)氨基酸（sequence 1 from patent US 5424286 39aa），應(yīng)用DNASIS計(jì)算機(jī)軟件分析Exendin-4的開放閱讀框（ORF）和它的編碼子，截取39肽的編碼cDNA，設(shè)計(jì)正、負(fù)向引物/模板鏈，正向引物的5端設(shè)計(jì)加入Nae酶切位點(diǎn)，負(fù)向引物的5端加入終止子和BamH 酶切位點(diǎn)。通過(guò)非對(duì)稱互補(bǔ)引物

5、/模板（重疊）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法獲得完整的Exendin-4，首先P1和P2互為引物和模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增Exendin-4 cDNA核心區(qū)，以第1次PCR產(chǎn)物為模板，P3、P4為引物合成完整的Exendin-4，且分別在引物P3、P4中引入Nae和BamH酶切位點(diǎn)和終止子。引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系：在100 L反應(yīng)總體積中，加入1 L （0.1 mg/L）DNA模板，1 L （50 mol/L）上游引物，1 L （50 mol/L）下游引物，2 L（10 mmol/L） dNTPs，10 L 10×Taq DNA聚合酶緩沖液，80 L消毒去離子水，最后在體系表面加50 L石蠟油；

6、沸水中煮5 min后，立即冰浴2 min，加1 L（1 U/L）TaqDNA聚合酶入反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件如下：94預(yù)變性1 min，進(jìn)入94 30 s，60 30 s，72 30 s，72延伸5 min，32個(gè)循環(huán)；取擴(kuò)增產(chǎn)物10 L進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，觀察電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳法回收，正丁醇濃縮，酚氯仿抽提，無(wú)水乙醇沉淀；將沉淀溶于20 L TE （pH 8.0），4保存?zhèn)溆谩?1.3.2 Exendin4 cDNA 的T載體克隆和序列測(cè)定 將PCR產(chǎn)物連接到線性克隆載體pGEM Teasy中，轉(zhuǎn)化Top10受體菌，氨基芐青霉素篩選陽(yáng)性克隆，堿裂解法小量提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶Eco

7、R酶切圖譜鑒定。連接反應(yīng)體系如下：用T4 DNA連接酶連接質(zhì)粒pGEM-Teasy和PCR產(chǎn)物，10 L反應(yīng)體積中加入1 L（50 mg/L）載體DNA，3 L（0.5 g/L） PCR產(chǎn)物，5 L 2×T4 DNA連接酶緩沖液，60水浴5 min，冰浴2 min，再加入1 L（3 U/L） T4 DNA連接酶，4水浴過(guò)夜。用CaCl2法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化菌在表面涂有X-gal和IPTG的瓊脂平板（Amp+）上進(jìn)行培養(yǎng)。挑選單個(gè)白色菌落，接種于10 mL LB培養(yǎng)液，37振搖培養(yǎng)16 h。用堿裂解法提質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶EcoR酶切分析法篩選陽(yáng)性

8、克隆，篩選到的重組子命名為pGEM-T/Exn-4。 1.3.3 核苷酸序列分析克隆基因序列 鑒定后的陽(yáng)性重組質(zhì)粒DNA，用T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子作為雙向測(cè)序引物，雙脫氧末端終止法測(cè)定克隆基因序列。 2 結(jié)果 2.1 目的基因Exendin-4 cDNA PCR結(jié)果 以互為模板的引物進(jìn)行PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，所得產(chǎn)物與PCR Marker比較，在約136 bp處得到一條單一清晰的條帶，與目的片段預(yù)期大小一致。見圖1。 2.2 重組質(zhì)粒pGEM-T/Exn-4酶切鑒定 構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pGEM-T/Exn-4，大小為3015+136 bp。經(jīng)EcoR酶切后，瓊脂糖凝膠電泳

9、結(jié)果可見136 bp的目的片段，與理論值相符，說(shuō)明Exendin-4已重組于pGEM-Teasy內(nèi)。見圖2。 2.3 Exendin-4的基因克隆測(cè)序結(jié)果 Exendin-4 cDNA 測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)序列經(jīng)Blast比較完全一致。見圖3。 3 討論 GLP-1不僅具有降糖作用，還可以減輕體重、改善血脂，達(dá)到直接或間接的心血管保護(hù)效應(yīng)6，但GLP-1分泌后很快被二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase ，DPP-）降解，體內(nèi)半衰期僅為2 min左右，很難應(yīng)用于臨床7。Exendin-4是從美國(guó)西南部大毒蜥唾液中分泌的天然腸促胰島素?cái)M似物，具有與GLP-1相似的促進(jìn)胰島素分泌功能，其

10、生物活性比GLP-1高5000倍左右，且DPP-對(duì)Exendin-4酶解作用弱，因此，Exendin-4被認(rèn)為是理想的治療2型糖尿病的新型藥物。人工合成的Exendin-4 （Exenatide，商品名為Byetta）是首個(gè)獲準(zhǔn)上市的腸促胰島素?cái)M似物8-9。然而，天然Exendin-4的提取成本高，難以滿足臨床應(yīng)用需要。由于Exendin-4是一個(gè)只有39個(gè)氨基酸的短肽，體內(nèi)半衰期短，穩(wěn)定性差，因此，限制其在臨床應(yīng)用。用基因工程方法直接生產(chǎn)Exendin-4，表達(dá)水平低且容易降解，與載體蛋白融合表達(dá)也存在產(chǎn)量低、分離純化困難等問(wèn)題。為解決這一難題，本實(shí)驗(yàn)擬將Exendin-4 cDNA導(dǎo)入到分

11、泌表達(dá)生物活性肽的專用載體，分泌表達(dá)目的蛋白Exendin-4，既可保證重組蛋白的活性又可避免原核表達(dá)高昂的生產(chǎn)成本。 重疊延伸PCR技術(shù)（gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR）是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)10。重疊延伸PCR在基因的定點(diǎn)突變、融合基因的構(gòu)建、長(zhǎng)片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴(kuò)增等方面有其廣泛而獨(dú)特的應(yīng)用。此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進(jìn)行有效的基因重組，技術(shù)成功的關(guān)鍵是重疊互補(bǔ)引物的設(shè)計(jì)。本研究依據(jù)美國(guó)專利檢索到Exe

12、ndin-4為39aa，序列如下：hgegtftsdl skqmeeeavr lfiewlkngg pssgappps。使用DNAsis軟件分析Exendin-4的ORF和它的編碼子，截取編碼39肽的cDNA，編輯完整的Exendin-4表達(dá)盒并使用DNAsis軟件分析。由于Exendin-4是從美國(guó)西南部大毒蜥唾液中分泌的物質(zhì)，沒(méi)有現(xiàn)成的模板行PCR擴(kuò)增，因此本實(shí)驗(yàn)利用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增出Exendin-4目的基因，并成功構(gòu)建了Exendin-4重組載體，用T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子脫氧末端終止法測(cè)定了克隆基因序列，DNA序列測(cè)定的結(jié)果與GenBank提供的已知序列比較完全一致，為進(jìn)一步構(gòu)建重

13、組質(zhì)粒分泌表達(dá)Exendin-4蛋白奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本文方法簡(jiǎn)單可行，其結(jié)果將為利用基因工程的方法大量生產(chǎn)和純化高純度的Exendin-4提供良好基礎(chǔ)。 參考文獻(xiàn) 1 Nathan DM，Buse JB，Davidsen MB，et al. Medical management of hyperglycemia in type 2 diabetes：a consensus algorithm for the initiation and adjustment of therapy：a consensus statement of the American Diabe tes Associati

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