利用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜（MALDITOFMS

1、應用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜源后衰變技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)項目完成單位：國家生物醫(yī)學分析中心項目完成人：王杰 楊松成 吳勝明 王紅霞 魏開華 張學敏 摘 要 目的：應用PSD技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索鑒定2DE膠上的蛋白質(zhì)斑點。 方法：用已知多肽（ACTH）1839肽段和TPA被胰酶降解后的1個肽段建立了PSD- MALDI-TOF-MS方法。結(jié)果：2DE分離后膠上的2個未知蛋白質(zhì)斑點應用已建立的PSD- MALDI-TOF-MS法分別被明確鑒定為40S ribosomal protein S12和dnaK suppressor protein。結(jié)論：PSD技術(shù)在蛋白質(zhì)組學研究中有較大的應用前景。關(guān)鍵

2、詞 蛋白質(zhì)組學；源后衰變；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜；肽質(zhì)量指紋譜；多肽測序一、前言蛋白質(zhì)組學是當前生命科學研究的前沿領(lǐng)域。對蛋白質(zhì)快速、準確的鑒定是蛋白質(zhì)組學研究中必不可少的關(guān)鍵性的一步1。采用MALDI-TOF-MS測得肽質(zhì)量指紋譜（PMF）在數(shù)據(jù)庫中查詢識別的方式鑒定蛋白質(zhì)，是目前蛋白質(zhì)組學研究中普遍應用的最主要的鑒定方法。但是，由于PMF鑒定結(jié)果的可靠性受諸多因素的影響，使得部分鑒定結(jié)果往往不是十分明確，特異性不高。多肽的氨基酸序列匹配被認為是特異性最好的鑒定方法。在蛋白質(zhì)組學研究中，利用質(zhì)譜測序一般采用兩種方式：一種是利用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）測序；另一種是利用源后衰變（PSD

3、）技術(shù)測序。應用PSD測序技術(shù)鑒定經(jīng)2DE分離蛋白質(zhì)的工作，國內(nèi)目前尚未見相關(guān)報道。 在反射式MALDI-TOF-MS中，當脈沖激光照射到微量樣品與飽和小分子基質(zhì)混合形成的共結(jié)晶上時，能量通過基質(zhì)傳遞給樣品，導致樣品被解析電離，電離后形成的亞穩(wěn)分子離子在飛經(jīng)無場區(qū)（即飛行管區(qū)）時發(fā)生裂解（其活化能來自在離子源與基體發(fā)生的碰撞，在無場區(qū)與殘留氣體的碰撞，激光輻射及各種熱機制等）所產(chǎn)生的子離子（即源后分解碎片離子），可以通過不斷改變反射器電壓來進行分離、收集并 記錄于檢測器，形成能為多肽和蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)提供十分豐富而有效的結(jié)構(gòu)信息的PSD質(zhì)譜圖25。利用PSD譜圖，結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索可以迅速、高特異性

4、地鑒定蛋白質(zhì)。 本研究采用MALDI-TOF-MS的源后衰變（PSD）技術(shù)對促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）1839肽段和組織型纖溶酶原激活劑（TPA）的酶解產(chǎn)物中選取的1個肽段進行了序列分析方法的驗證，建立了應用PSD技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索鑒定2DE分離膠上蛋白質(zhì)的方法，并應用該方法成功地對2DE膠上兩個不同的未知蛋白質(zhì)斑點進行了明確鑒定。二、實驗和方法1. 材料 促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）1839肽段為德國Bruker公司提供；組織型纖溶酶原激活劑（TPA）由廣州銘康藥業(yè)公司提供；經(jīng)2DE分離后的蛋白斑點A，B分別由軍事醫(yī)學科學院二所及八所提供；-氰基-4-羥基肉桂酸(-CCA，Bruker公司

5、)；三氟乙酸(TFA，F(xiàn)luka公司)；乙腈(CAN，F(xiàn)isher公司)；胰蛋白酶(Trypsin，Boehringe公司)為測序級；2. 儀器 德國Bruker公司MALDI-TOF-MS（FEFLEX III）；反射檢測方式；飛行管長3 m；氮激光器：波長337 nm。3. ACTH的處理：將精確稱取的促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）18-39肽段用含0.5%TFA的水溶解配成濃度為2µmolL-1的溶液。待用;4. TPA的處理：將50µg糖蛋白(TPA)溶解在500µL25mmolL-1碳酸氫氨溶液中,加入1µg胰蛋白酶(Trypsin)，37保溫反

6、應17h。待用；經(jīng)2DE分離后的蛋白斑點A、B的處理 膠內(nèi)酶切詳細方法見參考文獻6。5. 基質(zhì)：將CCA溶于含0.1%TFA的50%ACN溶液中，制成飽和溶液，離心，取上清，待用；6. 試樣 分別取1µL上述四種樣品待測液，各與1µL的飽和基質(zhì)上清液混合,取1µL分別點在Scorce384靶上，送入離子源中進行檢測。7. 結(jié)果7.1 多肽ACTH（1839）肽段與蛋白TPA酶解產(chǎn)物的源后衰變（PSD）譜圖的分析Ion intensity首先選用文獻7報道較多的促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）1839肽段對其進行了PSD測序，該肽段的一級結(jié)構(gòu)為RPVKVYPNGAEDE

7、SAEAFPLEF，準分子離子的分子量M+H+=2465.20。實驗結(jié)果見圖1。Figure 1 PSD spectra of ACTH fragment 1839 and searching result 將實驗所得數(shù)據(jù)經(jīng)Mascot的MS/MS Ion方式檢索得到唯一鑒定結(jié)果為促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH），綜合評判分值(score)為72分（超過34分有效）。從結(jié)果可以看出，在應用PSD技術(shù)對該肽段進行測序分析時，能夠得到豐富的碎片離子，由此可推算出較多的序列信息，這也是該肽段在利用PSD技術(shù)測序方法學研究中應用廣泛的原因之一。在本次實驗中，我們測得了兩個a型離子的序列片段，一段是a8a1

8、1的-GAE-，一段是a13a17的-SAEA-，另有一個含有兩個殘基的b型離子序列片段b6b8的PN以及其他幾個不同離子類型單個氨基酸殘基。Ion intensity 為了優(yōu)化實驗條件并進一步對PSD的測序功能進行研究，選取蛋白TPA酶切后的一個肽段（m/z2184.11）進行PSD測序分析，實驗結(jié)果見圖2。 Figure 2 PSD spectra of m/z2184.11 peptide from TPA after enzyme digestion and searching result 將實驗所得數(shù)據(jù)經(jīng)Mascot的MS/MS Ion方式檢索得到唯一結(jié)果為組織型纖溶酶原激活劑（T

9、PA），score值為62分（超過42分有效）。從結(jié)果可以看出，在此PSD譜圖中，雖然碎片離子信息不如ACTH的豐富，但卻測得了一段較長b型離子的序列片段，即b1b6的-QMIYQ-，以及較短的一段是b8b10的-QS-。 可以看出，無論是多肽樣品還是蛋白的酶切肽段均可通過對其所測的PSD譜圖進行數(shù)據(jù)庫查詢得到高特異性的鑒定結(jié)果。2經(jīng)2DE分離后的蛋白斑點A和B的PMF譜及PSD譜分析 目前，在蛋白質(zhì)組學研究中，有部分經(jīng)2DE分離的未知蛋白質(zhì)樣品無法通過MALDI-TOF-MS的PMF得到鑒定或鑒定結(jié)果不明確，如再將PSD-MALDI-TOF-MS的測序功能應用于對這些蛋白質(zhì)的進一步明確鑒定時

10、，PSD技術(shù)在蛋白質(zhì)組學研究中，將能發(fā)揮更大的作用。圖3是對經(jīng)2DE分離后的蛋白斑點A用MALDI-TOF-MS測得的PMF及檢索結(jié)果。Ion intensity Figure 3 PMF spectra of spot A unknow protein and searching result 從圖3可以看出，此PMF譜圖的肽段數(shù)目適中、分布合理。在實驗中采用外標法，利用7個標準肽段在8003500u的質(zhì)量范圍之內(nèi)對儀器的質(zhì)量進行了校正。實驗測得胰酶自切峰與理論值之間的質(zhì)量誤差為0.05u（理論上自切峰的m/z2163.05），表明所測PMF譜圖在此質(zhì)量范圍內(nèi)的誤差很小。但該數(shù)據(jù)經(jīng)Masco

11、t的PMF方式檢索得到的結(jié)果均未超過有效值（都在陰影區(qū)），說明蛋白斑點A通過PMF鑒定，沒有獲得成功。Ion intensity 為了進一步鑒定蛋白斑點A，選取圖3中m/z1750.98峰做PSD測序分析。實驗結(jié)果見圖4。 Figure 4 PSD spectra of m/z1750.98 peptide from spot A after trypsin digestion and searching result 該圖實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Mascot的MS/MS Ion方式檢索得到唯一結(jié)果為40S ribosomal protein S12 ，score值為82分（超過37分有效）。檢索結(jié)果顯示，

12、該肽段共有15個氨基酸殘基，序列為LVEALCAEHQINLIK。在實驗中測得了兩個較長的b型離子的序列片段，一段是b2b7的-EALCA-，一段是b9b15的-QINLIK-。PSD譜圖中未顯示b1和b8離子，故而未測得該肽段的全序列。一段完整的序列，無論是對蛋白質(zhì)的鑒定還是完成對全新蛋白質(zhì)的基因工程表達，均具有重要意義。因此，如果通過PSD測得到1個多肽的全序列，將更具有實際的應用價值。 Ion intensity圖5是經(jīng)2DE分離后蛋白斑點B用MALDI-TOF-MS測得的PMF譜圖及檢索結(jié)果。Figure 5 PMF spectra of spot B unknow protein a

13、nd searching result從圖5可以看出，實際測得胰酶自切峰與理論值之間的質(zhì)量誤差為0.03u（理論上自切峰的m/z2273.160）。經(jīng)Mascot的PMF方式檢索顯示有兩個有效結(jié)果：dnaK suppressor protein Escherichia coli O157:H7 EDL933（116分）及dosage-dependent dnaK suppressor protein Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi(98分)。檢索出的這兩個蛋白質(zhì)的序列高度相似，只有微小的差異，此時通過PMF的鑒定結(jié)果很難在這兩

14、個蛋白之間作出肯定的判斷。為了得到更明確的鑒定結(jié)果，選取圖5中m/z1421.72峰做PSD測序分析。實驗結(jié)果見圖6。Ion intensity Figure 6 PSD spectra of m/z1421.72 peptide from spot B after trypsin digestion and searching result 圖6的PSD實驗結(jié)果顯示了該肽段的全序列，并且是y型離子，該肽段共12個氨基酸殘基，其一級結(jié)構(gòu)為（R）LELSFEEEQAA。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Mascot的MS/MS Ion方式檢索得到唯一結(jié)果為dnaK suppressor protein Escheric

15、hia coli O157:H7 EDL933，score值為136分（超過26分有效），實驗獲得了明確的鑒定結(jié)果。三、討論現(xiàn)代生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，為鑒定蛋白質(zhì)提供了一種簡便、快速、準確、靈敏的方法。在當前蛋白質(zhì)組學研究中，主要應用MALDI-TOF-MS測得PMF的技術(shù)和用串聯(lián)質(zhì)譜獲得多肽序列信息（PST）的技術(shù)，鑒定2DE分離后的蛋白質(zhì)斑點。前者由于多種原因?qū)傩圆桓?，鑒定蛋白質(zhì)的成功率一般在50%左右；后者由于專屬性強，鑒定蛋白質(zhì)的成功率高達80%90%。PSD作為測定多肽序列的一種技術(shù)，目前的應用范圍遠不如串聯(lián)質(zhì)譜廣泛。由實驗可看出：應用PSD技術(shù)對蛋白質(zhì)進行序列分析，同樣具有很高的專

16、屬性，不僅可以對已知多肽樣品或蛋白質(zhì)的酶解肽段作出高特異性的鑒定結(jié)果，更重要的是可以對那些經(jīng)PMF無法鑒定或鑒定結(jié)果不明確的蛋白質(zhì)作出快速、靈敏、準確的鑒定，能夠獲得唯一的鑒定結(jié)果。應用PSD技術(shù)測定多肽的序列時，實驗是否能夠成功與所測定的多肽的一級結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)系。正如文獻7所報道的那樣，并不是所有的多肽都適合用PSD技術(shù)進行序列分析。圖5中m/z2362.12豐度很強的肽段，應用PSD技術(shù)對其進行測序時，未獲得成功。在應用PSD-MALDI-TOF-MS技術(shù)測定多肽的序列時，實驗結(jié)果的好壞也取決于實驗時對儀器參數(shù)的設定，尤其是對反射電壓和激光能量這兩個參數(shù)的選擇。當激光能量太強時，將導致P

17、SD的離子碎片集中在低質(zhì)量端；而激光能量太弱時，又無法得到多肽的序列信息。只有當反射電壓和激光能量二者都選擇合適時，才能得到好的PSD譜圖，獲得有價值的結(jié)構(gòu)信息。隨著對PSD技術(shù)的不斷研究和發(fā)展，尤其是結(jié)合MALDI-TOF-MS本身所具有的高靈敏度、高通量、樣品靶點可多次應用測定、分析時主要產(chǎn)生單電荷準分子離子以及能夠耐受一定量的鹽和干擾物等特點，PSD-MALDI-TOF-MS將會在蛋白質(zhì)組學、代謝組學以及藥物篩選的研究中發(fā)揮更大的作用。參考文獻1Wasinger VC，Cordwell SJ，Cerpa-Poljak A，et al. Progress with gene-product

18、 mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium， Electrophoresis，1995 ;16(7):10901094.2Spengler B. Post-source decay analysis in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biomolecules. J Mass Spectrom,1997,32:10191036.3Kaufmann R，Spengler B，Lutzenkirchen F. Mass spectrometric sequencing of linear peptides by product-ion analysis in a reflectron time-of-flight mass spectrometer using matrix-assisted laser desorption ionization.Rapid Commun Mass Spectrom 1993 ;7(10):902910.4Chait BT，Kent