利用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOFMS

1、應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜源后衰變技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)項(xiàng)目完成單位：國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心項(xiàng)目完成人：王杰 楊松成 吳勝明 王紅霞 魏開華 張學(xué)敏 摘 要 目的：應(yīng)用PSD技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定2DE膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。 方法：用已知多肽（ACTH）1839肽段和TPA被胰酶降解后的1個(gè)肽段建立了PSD- MALDI-TOF-MS方法。結(jié)果：2DE分離后膠上的2個(gè)未知蛋白質(zhì)斑點(diǎn)應(yīng)用已建立的PSD- MALDI-TOF-MS法分別被明確鑒定為40S ribosomal protein S12和dnaK suppressor protein。結(jié)論：PSD技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中有較大的應(yīng)用前景。關(guān)鍵

2、詞 蛋白質(zhì)組學(xué)；源后衰變；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；肽質(zhì)量指紋譜；多肽測(cè)序一、前言蛋白質(zhì)組學(xué)是當(dāng)前生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域。對(duì)蛋白質(zhì)快速、準(zhǔn)確的鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中必不可少的關(guān)鍵性的一步1。采用MALDI-TOF-MS測(cè)得肽質(zhì)量指紋譜（PMF）在數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢識(shí)別的方式鑒定蛋白質(zhì)，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中普遍應(yīng)用的最主要的鑒定方法。但是，由于PMF鑒定結(jié)果的可靠性受諸多因素的影響，使得部分鑒定結(jié)果往往不是十分明確，特異性不高。多肽的氨基酸序列匹配被認(rèn)為是特異性最好的鑒定方法。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，利用質(zhì)譜測(cè)序一般采用兩種方式：一種是利用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）測(cè)序；另一種是利用源后衰變（PSD

3、）技術(shù)測(cè)序。應(yīng)用PSD測(cè)序技術(shù)鑒定經(jīng)2DE分離蛋白質(zhì)的工作，國(guó)內(nèi)目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。 在反射式MALDI-TOF-MS中，當(dāng)脈沖激光照射到微量樣品與飽和小分子基質(zhì)混合形成的共結(jié)晶上時(shí)，能量通過(guò)基質(zhì)傳遞給樣品，導(dǎo)致樣品被解析電離，電離后形成的亞穩(wěn)分子離子在飛經(jīng)無(wú)場(chǎng)區(qū)（即飛行管區(qū)）時(shí)發(fā)生裂解（其活化能來(lái)自在離子源與基體發(fā)生的碰撞，在無(wú)場(chǎng)區(qū)與殘留氣體的碰撞，激光輻射及各種熱機(jī)制等）所產(chǎn)生的子離子（即源后分解碎片離子），可以通過(guò)不斷改變反射器電壓來(lái)進(jìn)行分離、收集并 記錄于檢測(cè)器，形成能為多肽和蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)提供十分豐富而有效的結(jié)構(gòu)信息的PSD質(zhì)譜圖25。利用PSD譜圖，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索可以迅速、高特異性

4、地鑒定蛋白質(zhì)。 本研究采用MALDI-TOF-MS的源后衰變（PSD）技術(shù)對(duì)促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）1839肽段和組織型纖溶酶原激活劑（TPA）的酶解產(chǎn)物中選取的1個(gè)肽段進(jìn)行了序列分析方法的驗(yàn)證，建立了應(yīng)用PSD技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定2DE分離膠上蛋白質(zhì)的方法，并應(yīng)用該方法成功地對(duì)2DE膠上兩個(gè)不同的未知蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行了明確鑒定。二、實(shí)驗(yàn)和方法1. 材料 促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）1839肽段為德國(guó)Bruker公司提供；組織型纖溶酶原激活劑（TPA）由廣州銘康藥業(yè)公司提供；經(jīng)2DE分離后的蛋白斑點(diǎn)A，B分別由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所及八所提供；-氰基-4-羥基肉桂酸(-CCA，Bruker公司

5、)；三氟乙酸(TFA，F(xiàn)luka公司)；乙腈(CAN，F(xiàn)isher公司)；胰蛋白酶(Trypsin，Boehringe公司)為測(cè)序級(jí)；2. 儀器 德國(guó)Bruker公司MALDI-TOF-MS（FEFLEX III）；反射檢測(cè)方式；飛行管長(zhǎng)3 m；氮激光器：波長(zhǎng)337 nm。3. ACTH的處理：將精確稱取的促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）18-39肽段用含0.5%TFA的水溶解配成濃度為2µmolL-1的溶液。待用;4. TPA的處理：將50µg糖蛋白(TPA)溶解在500µL25mmolL-1碳酸氫氨溶液中,加入1µg胰蛋白酶(Trypsin)，37保溫反

6、應(yīng)17h。待用；經(jīng)2DE分離后的蛋白斑點(diǎn)A、B的處理 膠內(nèi)酶切詳細(xì)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)6。5. 基質(zhì)：將CCA溶于含0.1%TFA的50%ACN溶液中，制成飽和溶液，離心，取上清，待用；6. 試樣 分別取1µL上述四種樣品待測(cè)液，各與1µL的飽和基質(zhì)上清液混合,取1µL分別點(diǎn)在Scorce384靶上，送入離子源中進(jìn)行檢測(cè)。7. 結(jié)果7.1 多肽ACTH（1839）肽段與蛋白TPA酶解產(chǎn)物的源后衰變（PSD）譜圖的分析Ion intensity首先選用文獻(xiàn)7報(bào)道較多的促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）1839肽段對(duì)其進(jìn)行了PSD測(cè)序，該肽段的一級(jí)結(jié)構(gòu)為RPVKVYPNGAEDE

7、SAEAFPLEF，準(zhǔn)分子離子的分子量M+H+=2465.20。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。Figure 1 PSD spectra of ACTH fragment 1839 and searching result 將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)Mascot的MS/MS Ion方式檢索得到唯一鑒定結(jié)果為促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH），綜合評(píng)判分值(score)為72分（超過(guò)34分有效）。從結(jié)果可以看出，在應(yīng)用PSD技術(shù)對(duì)該肽段進(jìn)行測(cè)序分析時(shí)，能夠得到豐富的碎片離子，由此可推算出較多的序列信息，這也是該肽段在利用PSD技術(shù)測(cè)序方法學(xué)研究中應(yīng)用廣泛的原因之一。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們測(cè)得了兩個(gè)a型離子的序列片段，一段是a8a1

8、1的-GAE-，一段是a13a17的-SAEA-，另有一個(gè)含有兩個(gè)殘基的b型離子序列片段b6b8的PN以及其他幾個(gè)不同離子類型單個(gè)氨基酸殘基。Ion intensity 為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件并進(jìn)一步對(duì)PSD的測(cè)序功能進(jìn)行研究，選取蛋白TPA酶切后的一個(gè)肽段（m/z2184.11）進(jìn)行PSD測(cè)序分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。 Figure 2 PSD spectra of m/z2184.11 peptide from TPA after enzyme digestion and searching result 將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)Mascot的MS/MS Ion方式檢索得到唯一結(jié)果為組織型纖溶酶原激活劑（T

9、PA），score值為62分（超過(guò)42分有效）。從結(jié)果可以看出，在此PSD譜圖中，雖然碎片離子信息不如ACTH的豐富，但卻測(cè)得了一段較長(zhǎng)b型離子的序列片段，即b1b6的-QMIYQ-，以及較短的一段是b8b10的-QS-。 可以看出，無(wú)論是多肽樣品還是蛋白的酶切肽段均可通過(guò)對(duì)其所測(cè)的PSD譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)查詢得到高特異性的鑒定結(jié)果。2經(jīng)2DE分離后的蛋白斑點(diǎn)A和B的PMF譜及PSD譜分析 目前，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，有部分經(jīng)2DE分離的未知蛋白質(zhì)樣品無(wú)法通過(guò)MALDI-TOF-MS的PMF得到鑒定或鑒定結(jié)果不明確，如再將PSD-MALDI-TOF-MS的測(cè)序功能應(yīng)用于對(duì)這些蛋白質(zhì)的進(jìn)一步明確鑒定時(shí)

10、，PSD技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，將能發(fā)揮更大的作用。圖3是對(duì)經(jīng)2DE分離后的蛋白斑點(diǎn)A用MALDI-TOF-MS測(cè)得的PMF及檢索結(jié)果。Ion intensity Figure 3 PMF spectra of spot A unknow protein and searching result 從圖3可以看出，此PMF譜圖的肽段數(shù)目適中、分布合理。在實(shí)驗(yàn)中采用外標(biāo)法，利用7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)肽段在8003500u的質(zhì)量范圍之內(nèi)對(duì)儀器的質(zhì)量進(jìn)行了校正。實(shí)驗(yàn)測(cè)得胰酶自切峰與理論值之間的質(zhì)量誤差為0.05u（理論上自切峰的m/z2163.05），表明所測(cè)PMF譜圖在此質(zhì)量范圍內(nèi)的誤差很小。但該數(shù)據(jù)經(jīng)Masco

11、t的PMF方式檢索得到的結(jié)果均未超過(guò)有效值（都在陰影區(qū)），說(shuō)明蛋白斑點(diǎn)A通過(guò)PMF鑒定，沒(méi)有獲得成功。Ion intensity 為了進(jìn)一步鑒定蛋白斑點(diǎn)A，選取圖3中m/z1750.98峰做PSD測(cè)序分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。 Figure 4 PSD spectra of m/z1750.98 peptide from spot A after trypsin digestion and searching result 該圖實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Mascot的MS/MS Ion方式檢索得到唯一結(jié)果為40S ribosomal protein S12 ，score值為82分（超過(guò)37分有效）。檢索結(jié)果顯示，

12、該肽段共有15個(gè)氨基酸殘基，序列為L(zhǎng)VEALCAEHQINLIK。在實(shí)驗(yàn)中測(cè)得了兩個(gè)較長(zhǎng)的b型離子的序列片段，一段是b2b7的-EALCA-，一段是b9b15的-QINLIK-。PSD譜圖中未顯示b1和b8離子，故而未測(cè)得該肽段的全序列。一段完整的序列，無(wú)論是對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定還是完成對(duì)全新蛋白質(zhì)的基因工程表達(dá)，均具有重要意義。因此，如果通過(guò)PSD測(cè)得到1個(gè)多肽的全序列，將更具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。 Ion intensity圖5是經(jīng)2DE分離后蛋白斑點(diǎn)B用MALDI-TOF-MS測(cè)得的PMF譜圖及檢索結(jié)果。Figure 5 PMF spectra of spot B unknow protein a

13、nd searching result從圖5可以看出，實(shí)際測(cè)得胰酶自切峰與理論值之間的質(zhì)量誤差為0.03u（理論上自切峰的m/z2273.160）。經(jīng)Mascot的PMF方式檢索顯示有兩個(gè)有效結(jié)果：dnaK suppressor protein Escherichia coli O157:H7 EDL933（116分）及dosage-dependent dnaK suppressor protein Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi(98分)。檢索出的這兩個(gè)蛋白質(zhì)的序列高度相似，只有微小的差異，此時(shí)通過(guò)PMF的鑒定結(jié)果很難在這兩

14、個(gè)蛋白之間作出肯定的判斷。為了得到更明確的鑒定結(jié)果，選取圖5中m/z1421.72峰做PSD測(cè)序分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。Ion intensity Figure 6 PSD spectra of m/z1421.72 peptide from spot B after trypsin digestion and searching result 圖6的PSD實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了該肽段的全序列，并且是y型離子，該肽段共12個(gè)氨基酸殘基，其一級(jí)結(jié)構(gòu)為（R）LELSFEEEQAA。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Mascot的MS/MS Ion方式檢索得到唯一結(jié)果為dnaK suppressor protein Escheric

15、hia coli O157:H7 EDL933，score值為136分（超過(guò)26分有效），實(shí)驗(yàn)獲得了明確的鑒定結(jié)果。三、討論現(xiàn)代生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，為鑒定蛋白質(zhì)提供了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏的方法。在當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，主要應(yīng)用MALDI-TOF-MS測(cè)得PMF的技術(shù)和用串聯(lián)質(zhì)譜獲得多肽序列信息（PST）的技術(shù)，鑒定2DE分離后的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。前者由于多種原因?qū)傩圆桓?，鑒定蛋白質(zhì)的成功率一般在50%左右；后者由于專屬性強(qiáng)，鑒定蛋白質(zhì)的成功率高達(dá)80%90%。PSD作為測(cè)定多肽序列的一種技術(shù)，目前的應(yīng)用范圍遠(yuǎn)不如串聯(lián)質(zhì)譜廣泛。由實(shí)驗(yàn)可看出：應(yīng)用PSD技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行序列分析，同樣具有很高的專

16、屬性，不僅可以對(duì)已知多肽樣品或蛋白質(zhì)的酶解肽段作出高特異性的鑒定結(jié)果，更重要的是可以對(duì)那些經(jīng)PMF無(wú)法鑒定或鑒定結(jié)果不明確的蛋白質(zhì)作出快速、靈敏、準(zhǔn)確的鑒定，能夠獲得唯一的鑒定結(jié)果。應(yīng)用PSD技術(shù)測(cè)定多肽的序列時(shí)，實(shí)驗(yàn)是否能夠成功與所測(cè)定的多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)系。正如文獻(xiàn)7所報(bào)道的那樣，并不是所有的多肽都適合用PSD技術(shù)進(jìn)行序列分析。圖5中m/z2362.12豐度很強(qiáng)的肽段，應(yīng)用PSD技術(shù)對(duì)其進(jìn)行測(cè)序時(shí)，未獲得成功。在應(yīng)用PSD-MALDI-TOF-MS技術(shù)測(cè)定多肽的序列時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞也取決于實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)儀器參數(shù)的設(shè)定，尤其是對(duì)反射電壓和激光能量這兩個(gè)參數(shù)的選擇。當(dāng)激光能量太強(qiáng)時(shí)，將導(dǎo)致P

17、SD的離子碎片集中在低質(zhì)量端；而激光能量太弱時(shí)，又無(wú)法得到多肽的序列信息。只有當(dāng)反射電壓和激光能量二者都選擇合適時(shí)，才能得到好的PSD譜圖，獲得有價(jià)值的結(jié)構(gòu)信息。隨著對(duì)PSD技術(shù)的不斷研究和發(fā)展，尤其是結(jié)合MALDI-TOF-MS本身所具有的高靈敏度、高通量、樣品靶點(diǎn)可多次應(yīng)用測(cè)定、分析時(shí)主要產(chǎn)生單電荷準(zhǔn)分子離子以及能夠耐受一定量的鹽和干擾物等特點(diǎn)，PSD-MALDI-TOF-MS將會(huì)在蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)以及藥物篩選的研究中發(fā)揮更大的作用。參考文獻(xiàn)1Wasinger VC，Cordwell SJ，Cerpa-Poljak A，et al. Progress with gene-product

18、 mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium， Electrophoresis，1995 ;16(7):10901094.2Spengler B. Post-source decay analysis in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biomolecules. J Mass Spectrom,1997,32:10191036.3Kaufmann R，Spengler B，Lutzenkirchen F. Mass spectrometric sequencing of linear peptides by product-ion analysis in a reflectron time-of-flight mass spectrometer using matrix-assisted laser desorption ionization.Rapid Commun Mass Spectrom 1993 ;7(10):902910.4Chait BT，Kent