乳酸左氧氟沙星有關物質方法學驗證

1、左氧氟沙星（Levofloxacin）為氧氟沙星的左旋體，具有抗菌譜廣、抗菌作用強的特點。日本第一制藥株式會社于1993年在日本上市銷售左氧氟沙星原料及片劑，并現(xiàn)在已在英國、美國等多國上市。目前國內(nèi)已批準上市的左氧氟沙星有乳酸鹽、鹽酸鹽和甲磺酸鹽，三種加酸根的左氧氟沙星均有片劑、膠囊劑、注射劑等多種劑型上市。本次驗證根據(jù)乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液相關物質方法學驗證方案開展驗證工作。有關物質檢查方法的驗證主要項目有專屬性、耐用性、精密度等。1、儀器Agilent1260高效液相色譜儀（美國安捷倫）；電子天平CP225D（北京賽多利斯儀器公司）; 酸度計(上海大普儀器公司2、主要試劑表1主要試劑及

2、來源試劑名稱 級別 來源醋酸銨 AR 天津市優(yōu)譜化學試劑有限公司高氯酸鈉 AR 天津市科密歐化學試劑有限公司鹽酸 AR 重慶川東華東（集團）有限公司磷酸 AR 重慶川東華東（集團）有限公司乙腈 GR 雷尼韋爾（上海）貿(mào)易有限公司3、對照品來源及批號表2對照品來源信息表對照品名稱來源批號左氧氟沙星中國藥品生物制品檢定所130455-200604130455-201005氧氟沙星中國藥品生物制品檢定所130454-200604環(huán)丙沙星中國藥品生物制品檢定所130451-200302雜質A歐洲藥典標準品Batch 2.0雜質E歐洲藥典標準品Batch 3.04、樣品來源及批號4.1中試產(chǎn)品表3中試產(chǎn)

3、品信息表p 批號 規(guī)格 包裝形式4.2原研試劑來源及批號表4原研制劑產(chǎn)品信息表批號 規(guī)格 來源1205E59 100ml：0.5g 第一三共制藥（北京）有限公司5、方法與結果5.1色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以醋酸銨高氯酸鈉溶液（取醋酸銨4.0 g和高氯酸鈉7.0 g，加水1300 ml使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.2）- （8515）為流動相A，乙腈為流動相B；按下表5進行線性梯度洗脫。柱溫為40 ；流速為每分鐘1 ml。表5線性梯度洗脫比例表時間（分鐘）流動相A（%）流動相B（%）010001810002570303970304010005010005.2雜質測定法 稱取左氧

4、氟沙星對照品、環(huán)丙沙星對照品和雜質E對照品各適量，用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1 ml中約含左氧氟沙星1.2 mg、環(huán)丙沙星和雜質E各6 g的混合溶液，取10 l注入液相色譜儀，以294 nm為檢測波長，記錄色譜圖，左氧氟沙星峰的保留時間約為15分鐘。左氧氟沙星峰與雜質E峰和左氧氟沙星峰與環(huán)丙沙星峰的分離度應分別大于2.0與2.5。取對照溶液10 l注入液相色譜儀，以294 nm為檢測波長，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%。精密量取供試品溶液、對照溶液和雜質A對照品溶液各10 l，分別注入液相色譜儀，以294 nm和238 nm為檢測波長，記錄色譜圖。供試

5、品溶液色譜圖中如有雜質峰，含雜質A（238 nm檢測）按外標法以峰面積計算，不得過0.3%。其他單個雜質（294 nm檢測）峰面積不得大于對照溶液主峰面積（0.2%），其他各雜質（294 nm檢測）峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的2.5倍（0.5%）。供試品溶液色譜圖中任何小于對照溶液主峰面積0.1倍的雜質峰忽略不計。5.3專屬性試驗陰性干擾試驗（1）取0.1 mol/L鹽酸溶液，進樣測定；（2）6 mol/L氨溶液1 ml與水適量使溶解，用水稀釋至100ml，進樣測定；（3）輔料空白：按處方配置不含乳酸左氧氟沙星的輔料空白樣品，照供試品制備方法制備樣品，進樣測定；（4）乳酸左氧氟沙星氯化

6、鈉注射液：取本品按供試品制備方法制備，進樣測定。結論： 檢驗人： 復核人：取乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液分別進行高溫降解、酸降解、氫氧化鈉降解、光照降解和過氧化氫氧化降解，方法如下： 表6專屬性試驗結果樣品雜質A雜質峰總面積雜質個數(shù)雜質（%）未降解光照降解氧化降解高溫降解堿降解酸降解結論：檢驗人： 復核人：5.5耐用性試驗柱溫：色譜柱溫采用40，同時對30和35進行了考察。流速：分別0.8ml/min和1.0ml/min（分別記為低流速、高流速）進行考察。流動相比例變化醋酸銨高氯酸鈉溶液/乙腈(流動相比例：84.5/15.5、85.5/14.5（分別記為低鹽、高鹽）；醋酸銨高氯酸鈉溶液(緩沖鹽P

7、H：2.0、2.4（分別記為低pH，高pH）；不同色譜柱分別用3根不同廠家色譜柱（分別記為1#、2#、3#）進行考察。檢測波長變化檢測波長設定為289m,、299nm、233nm、243nm進行考察。以上試驗以檢測條件為基準（即原方法），每次試驗僅變動一個因素，其它因素不變。表7 耐用性試驗結果變更條件雜質A單雜總雜RSD%原方法柱溫3542流速低流速高流速緩沖鹽PH低PH高PH流動相比例低鹽高鹽檢測波長289nm299nm233nm243nm色譜柱1#2#3#結論： 檢驗人： 復核人：5.6檢測限與定量限（雜質A）檢測限：分別精密吸取不同濃度的雜質A對照品溶液注入液相色譜儀，依法測定 ，以信

8、噪比約為3：1時的進樣量為最低檢測限。定量限：分別精密吸取不同濃度的雜質A對照品溶液注入液相色譜儀，依法測定 ，以信噪比約為10：1時的進樣量為最低檢測限。結論： 檢驗人： 復核人：5.7線性與范圍（雜質A）精密稱取雜質A對照品18mg，置100ml量瓶中，加6mol/L氨溶液1ml與水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻得儲備液；量取該液逐級稀釋至含雜質A對照溶液的濃度為：0.9g/ml、1.8g/ml、2.7g/ml、3.6g/ml、5.4g/ml 、7.2g/ml，加6 mol/L氨溶液1 ml與水適量使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，的溶液作為線性溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積值

9、，以峰面積對進樣量回歸。表8 線性和范圍試驗結果編號雜質A濃度（g/ml）峰面積（A）10.921.832.743.655.467.2結論：檢驗人： 復核人：5.8精密度試驗精密量取雜質A對照品溶液、對照溶液各10l，進樣測定，記錄色譜圖，測定峰面積值。表9 重復性試驗結果樣品樣1樣2樣3樣4樣5樣6RSD%雜質A最大單雜其他雜質結論： 檢驗人： 復核人：由2名實驗人員、不同日期、采用不同儀器設備進樣分析。（樣品制備方法同重復性試驗）表10 中間精密度試驗結果雜質A樣品樣1樣2樣3樣4樣5RSD%1#儀器 （1）1#儀器 （2）2#儀器（1）2#儀器（2）最大單雜1#儀器 （1）1#儀器 （2

10、）2#儀器（1）2#儀器（2）其他雜質1#儀器 （1）1#儀器 （2）2#儀器（1）2#儀器（2）注：（1）、（2）代表不同的實驗人員。結論： 檢驗人： 復核人：精密量取雜質A對照品溶液10l，注入液相色譜儀，重復進樣6次，記錄色譜圖，測定峰面積值，計算平均峰面積和RSD。表11 雜質A進樣精密度試驗結果進樣數(shù)次123456RSD%雜質A結論： 檢驗人： 復核人：5.9準確度試驗（雜質A）量取中試樣品（C130301 01）15ml置25ml量瓶中，加0.1mol/L HCl溶液稀釋至刻度，搖勻，得準確度樣1。量取“5.7線性及范圍”項下儲備液5ml置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得雜

11、質A對照品儲備液。量取準確度樣1樣品5ml置10ml量瓶中，再量取雜質A對照品儲備液1.00ml置該量瓶中，加0.1mol/L HCl溶液稀釋至刻度，搖勻，得低濃度樣品；同法制備3份樣品。量取準確度樣1樣品5ml置10ml量瓶中，再量取雜質A對照品儲備液2.00ml置該量瓶中，加0.1mol/L HCl溶液稀釋至刻度，搖勻，得中濃度樣品；同法制備3份樣品。量取準確度樣1樣品5ml置10ml量瓶中，再量取雜質A對照品儲備液3.00ml置該量瓶中，加0.1mol/L HCl溶液稀釋至刻度，搖勻，得高濃度樣品；同法制備3份樣品。取上述各供試液測定其峰面積， 計算其回收率。表12雜質A方法準確度試驗結

12、果樣品測得濃度加入濃度回收率%平均回收率%RSD%低濃度樣品-1低濃度樣品-2低濃度樣品-3中濃度樣品-1中濃度樣品-2中濃度樣品-3高濃度樣品-1高濃度樣品-2高濃度樣品-3結論：檢驗人： 復核人：5.10溶液穩(wěn)定性量取中試樣品（批號）15ml置于50ml量瓶中，加0.1mol/L HCl溶液稀釋至刻度，搖勻，得有關物質測定供試樣品；取此樣品溶液于0h、4h、12h、16h進樣分析。 表13 溶液穩(wěn)定性試驗結果樣品放置時間(h雜峰數(shù)目主成分峰面積RSD%0h4h12h16h結論： 檢驗人： 復核人：5.11兩種有關物質測定方法的對比研究分別用本公司生產(chǎn)的兩種包裝形式（聚丙烯輸液瓶、聚丙烯共混輸液袋）和本產(chǎn)品原研廠家（第一三共制藥有限公司）樣品進行了有關物質測定方法的對比測定，結果見表。表14 兩種測定方法的對比測定結果批號原方法新方法雜質個數(shù)（個）有關物質量（%）雜質個