獼猴耳廓軟骨細胞體外不同的培養(yǎng)方式與生長活性

1、    獼猴耳廓軟骨細胞體外不同的培養(yǎng)方式與生長活性        摘要目的：探討獼猴耳廓軟骨細胞在體外不同介質(zhì)的培養(yǎng)情況及其生長活性。材料與方法：對6只獼猴進行耳廓軟骨取材、軟骨細胞的分離，并行單層貼壁培養(yǎng)及在人工基質(zhì)上的培養(yǎng)。通過倒置顯微境和掃描電鏡觀察不同方式培養(yǎng)的細胞生長情況。結(jié)果：單層貼壁培養(yǎng)的軟骨細胞可傳代56代，但第三代軟骨細胞分泌的型與型膠原的能力無明顯差別；在幾丁質(zhì)上培養(yǎng)的軟骨細胞能保持體內(nèi)細胞的正常形態(tài)；在VICRYL上培養(yǎng)的軟骨細胞能分泌軟骨基質(zhì)。結(jié)論：

2、不同的體外培養(yǎng)方式下軟骨細胞的生長活性略有不同，需根據(jù)不同的實驗要求選擇相應(yīng)的培養(yǎng)方式。關(guān)鍵詞獼猴；耳廓軟骨；細胞培養(yǎng)；人工基質(zhì)中分類號R783.5文獻標(biāo)識碼A文章編號1000-4661(2000)04-0257-03Cellular activities with different cultivations of auricular chondrocytes from rhesus monkeysZHANG Jin-ning, WANG Xu-dong,YANG Chi.(School of Stomatology, Shanghai Second Medical University,S

3、hanghai, 200011)Abstract Objective:To observe the cellular activities with different cultivations of chondrocytes of auricular cartilages from rhesus monkeys.Methods:The chondrocytes of auricular cartilages from 6 rhesus monkeys were isolated and cultured in monolayer and in matrices.The changes of

4、cellular morphology were investigated with inverted microscope and scanning electron microscope(SEM).The cellular activities were studied with immunohistochemistry(IHC).Results:The chondrocytes cultured in monolayer were polygonal,and IHC showed that there was no significant difference between type

5、and type collagen stain in 3rd generation.The morphology of chondrocytes cultured in chitin were spherical,similar with the morphology in vivo.The chondrocytes cultured in VICRYL can secret ground substance of cartilage.Conclusions:The cellular activities with different cultivations of chondrocytes

6、is somehow different.Key wordsRhesus monkey;Auricular cartilage;Chondrocyte cultivation;matrice細胞生存環(huán)境不同所表現(xiàn)的生物學(xué)特性有所差別。而軟骨細胞的培養(yǎng)是組織工程化軟骨最基礎(chǔ)的步驟。不同的培養(yǎng)方式獲得的軟骨細胞經(jīng)移植后形成的軟骨成分有差異1。因此有必要對體外培養(yǎng)的軟骨細胞進行不同培養(yǎng)方式的研究。本實驗對獼猴耳廓軟骨細胞進行了單層培養(yǎng)和在立體人工基質(zhì)上培養(yǎng)的研究，探討獼猴耳廓軟骨細胞在體外不同介質(zhì)的培養(yǎng)情況及其生長活性。材料與方法一、實驗動物獼猴6只，58歲(青年獼猴)，雄性，體重68kg。由上海西

7、普爾動物實驗中心提供。二、方法1. 軟骨細胞懸液的制備無菌條件下通過背側(cè)進路獲取獼猴一側(cè)的耳甲軟骨。將取下的耳甲軟骨表面的軟骨膜剝離，剪成2mm×2mm大小碎片，磷酸鹽緩沖液(PBS，含青、鏈霉素各100u/ml)沖洗3遍，加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶(Sigma,USA)，置于37恒溫振蕩器(精華THZ-95型，江蘇)內(nèi)消化1h；取出標(biāo)本，棄去胰蛋白酶液體，加入含血清的培養(yǎng)液中止胰蛋白酶消化；然后再加入3倍體積的0.1%型膠原酶(Sigma,USA)，再置于37恒溫搖床內(nèi)消化812h。見大部分軟骨塊被消化后，以200目尼龍網(wǎng)篩過濾，收集消化液，1000r/min離心5min使細

8、胞沉淀。沉淀細胞以PBS洗3次，以洗去細胞表面的消化酶。加入Ham'F-12培養(yǎng)液制成細胞液(Gibco,Gland Island,USA)，含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺300g/ml,維生素C 50g/ml,青、鏈霉素各100u/ml。臺盼藍染色計數(shù)。2. 軟骨細胞的培養(yǎng)與觀察(1)單層貼壁培養(yǎng)：將記數(shù)后的細胞移入25ml培養(yǎng)瓶中，每瓶接種細胞約5×105個，加入Ham'F-12培養(yǎng)液中，置于37、飽和濕度、5%CO2細胞孵箱(Forma Scientific,USA)內(nèi)培養(yǎng)，每2天換液1次，倒置顯微鏡(Olympus)下觀察并照相，細胞長滿后用0.25%胰蛋白酶

9、傳代。將生長良好的第三代軟骨細胞接種于玻璃片上，長滿后取出，PBS沖洗，95%酒精固定：蘇木精-伊紅(HE)染色；ABC法進行、型膠原免疫組化染色(、型膠原鼠抗人抗體，Neomarker,USA)。(2)加入人工基質(zhì)培養(yǎng)：將消毒完畢的幾丁質(zhì)(直徑15m纖細，間隔150200m，厚度100m，無紡網(wǎng)，由東華大學(xué)提供)和VICRYL(Polyglactin 910)可吸收膜(Ethicon,USA)剪成5mm×10mm大小，置入96孔培養(yǎng)板。每孔加入5×106細胞懸液200l，37孵箱內(nèi)放置4h后，每孔加入Ham'F-12培養(yǎng)液1ml,再置入37孵箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)液每3d

10、更換1次，倒置顯微鏡下觀察并照相。將VICRYL上培養(yǎng)1周的細胞立即用3%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，0.1M PBS沖洗后，乙醇梯度濃度逐級脫水，醋酸異戊酯置換，液體CO2臨界點干燥，真空離子鍍膜，JEOL-840掃描電鏡觀察。結(jié)果單層貼壁培養(yǎng)的軟骨細胞于接種后12h開始貼壁，2436h完成貼壁變形。其外形為多邊形，胞漿豐富，胞核清晰，有12個核仁，細胞長成一片可呈明顯的鋪路石狀外觀。經(jīng)過本方法消化發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)后僅見單一的軟骨細胞生長。細胞傳至67代后，體積開始變大，出現(xiàn)指狀突起，核變大，核仁增多，增殖速度減慢。HE染色見胞核呈藍紫色，胞漿淡紅色(1)。、膠原免疫組化染色見軟骨細胞胞漿染成棕黃色

11、，胞核不著色，、型膠原染色灰度無明顯差異。幾丁質(zhì)上培養(yǎng)的細胞在倒置顯微鏡下成球形或類球狀，粘附于網(wǎng)狀的纖維上，呈“樹上結(jié)果”樣(2)。VICRYL膜上培養(yǎng)的細胞在倒置顯微鏡下呈現(xiàn)類似貼壁狀，但具扁平的立體形態(tài)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)1周后的軟骨細胞在呈編織狀的VICRYL(3)上粘附生長，呈多邊形，分泌的基質(zhì)呈偽足樣纏繞在VICRYL支架表面。1培養(yǎng)軟骨細胞HE染色(×40)2幾丁質(zhì)上培養(yǎng)的軟骨細胞3VICRYL 膜上培養(yǎng)的軟骨細胞(SEM，×100)討論正常組織細胞的增殖是有限的。單層培養(yǎng)的軟骨細胞只能傳5代，因為傳代過程會造成細胞的反分化2，3。我們觀察到軟骨細胞傳至67代后

12、呈現(xiàn)明顯增殖緩慢及衰老現(xiàn)象。軟骨細胞在體內(nèi)分泌多種膠原。其中型膠原的含量最高。研究表明單層貼壁培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)后56d即可發(fā)生反分化。即使在高密度培養(yǎng)下，當(dāng)軟骨細胞傳至第3代時，細胞亦出現(xiàn)反分化，其分泌型膠原的能力下降4。本實驗發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的軟骨細胞具備分泌膠原的能力，但其、型膠原染色無顯著性差異，證實了在單層培養(yǎng)中，軟骨細胞形成軟骨基質(zhì)的能力逐漸下降，這也是細胞反分化的結(jié)果。但對單層培養(yǎng)而去分化的軟骨細胞，應(yīng)用低熔點的瓊脂糖進行培養(yǎng)，可促使細胞從合成型膠原轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚湍z原，即軟骨細胞出現(xiàn)再分化的現(xiàn)象5。傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法和培養(yǎng)系統(tǒng)，很難滿足立體組織器官的細胞生長所需的高標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境需求，因此出現(xiàn)

13、了在三維結(jié)構(gòu)支架上的立體細胞培養(yǎng)，并證實這種培養(yǎng)方法能明顯促進軟骨細胞合成型膠原基質(zhì)。我們嘗試了在幾丁質(zhì)上進行細胞培養(yǎng)。幾丁質(zhì)是一種疏松的無紡網(wǎng)結(jié)構(gòu)，軟骨細胞在其上生長呈圓形或類圓形，明顯區(qū)別于貼壁培養(yǎng)的細胞形態(tài)，而與體內(nèi)正常細胞形態(tài)接近?？山到馊斯ど锊牧蟅ICRYL是聚羥基乙酸(PGA)和聚乳酸(PLA)的聚合物，在其上的細胞培養(yǎng)也證實了軟骨細胞能為PGLA支架粘附，并在其上生長，分泌軟骨基質(zhì)。然而天然機體細胞都是處于機體提供的動力環(huán)境中生長的，組織工程的細胞培養(yǎng)需要模擬體內(nèi)組織生長所處的微環(huán)境動力學(xué)特征，既做到立體細胞培養(yǎng)，維持細胞正常形態(tài)和功能表達，又能通過動態(tài)流體環(huán)境，使?fàn)I養(yǎng)成分均勻

14、擴散進入整個細胞支架三維共聚體中，使細胞能獲得生長所必須的充分營養(yǎng)成分。根據(jù)這些設(shè)想和要求，研究者已構(gòu)建了多種提供動力微環(huán)境的培養(yǎng)系統(tǒng)。如，模擬微重力旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器(Simulated Microgravity in Rotating Bioreactors)系統(tǒng)、固體轉(zhuǎn)動生物反應(yīng)器(Solid Body Rotation in Rotating Bioreactors)系統(tǒng)、攪動混合旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶(Turbulent Mixing in Spinner Flasks)系統(tǒng)、環(huán)繞混合培養(yǎng)皿(Orbital Mixing in Petri Dishes)系統(tǒng)。Gooch KJ等6研究了在攪動混合旋轉(zhuǎn)

15、培養(yǎng)瓶系統(tǒng)中不同的混合強度對軟骨細胞的生長效應(yīng)，結(jié)果在該系統(tǒng)培養(yǎng)形成的軟骨含有較多的膠原成分。Sittinger M等7發(fā)明的灌注培養(yǎng)系統(tǒng)能恒定提供細胞所需的各種養(yǎng)分，在長期培養(yǎng)過程中能保持培養(yǎng)基pH值和葡萄糖濃度的穩(wěn)定，用于三維生物材料聚合物-細胞的培養(yǎng)試驗顯示出較好的效果，能為組織工程器官組織提供可靠的培養(yǎng)環(huán)境。此外，通過模擬機體環(huán)境中軟骨細胞所處的動態(tài)負載環(huán)境，給體外的三維培養(yǎng)體系加以動態(tài)的負載，如間斷性加壓負載，可促進體外軟骨細胞的細胞基質(zhì)合成8。綜上所述，不同培養(yǎng)方式的軟骨細胞表現(xiàn)出不同的生長活性，單層培養(yǎng)的細胞易出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，難以滿足組織工程技術(shù)的需要，而解決細胞出現(xiàn)反分化的現(xiàn)象

16、可能需要更先進的體外培養(yǎng)方式。作者簡介張金寧(1963-)，男，上海人，主治醫(yī)師，碩士。主要研究方向：牙髓病、根尖周病。張金寧(上海第二醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，上海200011)王旭東(上海第二醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，上海200011)楊馳(上海第二醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，上海200011)參考文獻1Wakitani S,Kimura T,Hirooka A,et al.Repair of rabbit articular surfaces with allograft chondrocytes embedded in collagen gelJ.J Bone Joint Surg,1989,71742F

17、reed LE,Grande Da,Lingbin Z,et al.Joint resurfacing using allograft chondrocytes and synthetic biodegradable polymer scaffoldsJ.J Biomed Mater Res,1994,288913Puelacher WC,Kin WS,Vacanti JP,et al.Tissue-engineered growth of cartilage:the effect of varying the concentration of chondrocytes seeded onto

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