分析人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后骨溶解及假體松動(dòng)的分子生物學(xué)機(jī)制

1、分析人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后骨溶解及假體松動(dòng)的分子生物學(xué)機(jī)制    【摘要】  目的 探討人工髖關(guān)節(jié)假體分離出的顆粒碎片刺激巨噬細(xì)胞而釋放的腫瘤壞死因子(TNF-)在人工髖關(guān)節(jié)術(shù)后引起骨溶解的作用機(jī)理。方法 采用鈦顆粒刺激巨噬細(xì)胞而釋放TNF-模型及酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡、凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)方法來研究其生物分子學(xué)機(jī)制。結(jié)果 鼠類巨噬細(xì)胞受鈦顆粒刺激而釋放TNF-，而JNK抑制劑 SP600125和 NF-B抑制劑MG132 大大抑制了鈦顆粒誘導(dǎo)的TNF-釋放，但p38抑制劑無此

2、作用，甚至，鈦顆粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞而激活A(yù)P-1 和 NF-B。結(jié)論 鈦顆粒誘導(dǎo)的TNF-釋放與JNK/AP-1及NF-B通路有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù) 鈦顆粒 骨溶解 腫瘤壞死因子    【Abstract】  Objective  To study the mechanism of  osteolysis after total

3、0;hip replacement by tumor necrosis factor- (TNF-) release in macrophages stimulated with particulate debris from prosthesis. Methods  A model of TNF- release by stimulating m

4、acrophages with titanium particles was made and study the mechanism of TNF- release by Elisa/West blot/EMSA. Results  TNF- was released in murine macrophage stimulated by 

5、;titanium (Ti) particles and specific inhibitors of JNK (SP600125) and NF-B (MG132), but not p38 (SB203580) dramatically inhibited Ti-stimulated TNF- release. Moreover,transcriptional activa

6、tion of AP-1 and NF-B was also induced by Ti particles. Conclusion  These results demonstrate that Ti particle-induced TNF- release is mediated through JNK/AP-1 as well&#

7、160;as NF-B pathways.    【Key words】  THR; Ti particles; osteolysis; TNF    人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍的骨溶解及隨后而來的假體疏松是置換術(shù)失敗的常見原因。由于假體長(zhǎng)時(shí)間磨損與腐蝕生成的顆粒碎片導(dǎo)致假體周圍形成假膜，這些假膜由肉芽腫形成，它包括巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、巨細(xì)胞及破骨細(xì)胞1，2。假體周圍膜組織的這些細(xì)胞受這些碎片顆粒而產(chǎn)生有關(guān)骨溶解及假體松動(dòng)的

8、炎癥因子如TNF-、白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-11及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-3，4。通過這些細(xì)胞因子的相互作用，破骨細(xì)胞被激活吸收骨組織，導(dǎo)致骨溶解及假體松動(dòng)。    這些炎癥因子中，TNF-是很重要的骨溶解因子。Kimble 等已證明TNF-可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞NF-B配位子（RANKLE）受體及巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(M-CSF)受體活性5。 而且，Ingham 等發(fā)現(xiàn)TNF-又直接促進(jìn)早破骨細(xì)胞分化并激活成熟的破骨細(xì)胞吸收骨組織6。與此同時(shí), Merkel 等通過去除腫瘤壞死因子

9、受體（TNFR）基因的動(dòng)物顱骨與PMMA 顆粒接觸，發(fā)現(xiàn)無骨溶解現(xiàn)象7。 這些結(jié)果顯示，TNF-是人工關(guān)節(jié)術(shù)后磨損顆粒導(dǎo)致的骨溶解重要細(xì)胞因子。 但至今,尚未報(bào)告與此相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制。本次實(shí)驗(yàn),通過鼠巨噬細(xì)胞受鈦顆粒刺激而釋放的TNF-模型來分析TNF-合成的分子生物學(xué)機(jī)制。     1  材料與方法    1.1  材料  DMEM培養(yǎng)基，牛胎血清（FBS）來自于Gibco Invitrogen

10、60;公司（Rockville.MD）。PD98059、SP600125、MG132 來自于Calbiochem (La Jola CA)?？沽姿?ERK /JNK/IkB 抗體來自于Cell Signaling Technology(Beverly,MA)。測(cè)定鼠TNF- ELISA 試劑盒來自于BioSource international(Madison WI)。EGCG 來自于Sigma (St Louis,MO)。硝基纖維膜及化學(xué)法光試

11、劑盒來自于Amershan Biosciences Corperation(Piscataway,NJ)。其余化學(xué)試劑來自于Sigma公司。    1.2  細(xì)胞培養(yǎng)  RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)在由10% FBS 及1% 青鏈霉素添加的DMEM 培養(yǎng)基以及5CO2濕潤(rùn)的37°C空氣中，等生長(zhǎng)到60%70%后計(jì)數(shù)并培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)皿（2×104細(xì)胞/孔） 或60mm 組織培養(yǎng)皿(2×106細(xì)胞皿)

12、，然后，細(xì)胞與已知濃度的PD98059、SP600125、MG132處理30min后，再與鈦顆粒處理。上清液及細(xì)胞收集后用于進(jìn)一步分析。    1.3  鈦顆粒準(zhǔn)備  鈦顆粒（13m）來自于 Cerac(Milwaukee,WI)。顆粒用25硝酸及95乙醇、0.1N氫氧化鈉混合液消毒（Ragab et al,1999）。顆粒內(nèi)毒素由Limulus Amebocyte Lysate 方法（Biowhittaker,Walkersville,MD）測(cè)定。

13、60;   1.4  方法    1.4.1  ELISA （酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定）  RAW264.7細(xì)胞（2×104/孔）在PD98059/SP600125/MG132 等抑制劑添加或不添加的情況下用鈦顆粒處理。TNF- 用ELISA 方法（BioSource）來測(cè)定。具體如下：將稀釋好的包被抗體加入ELISA板，100l/孔，4放置2448h。洗滌液沖洗ELISA板3次，加待測(cè)樣品、陰性對(duì)照及倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，1

14、00l/孔，37，1h。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法：取標(biāo)準(zhǔn)品，溶于100l標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中做1:100稀釋為10ng/ml以后再倍比稀釋至78pg/ml，即：10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml、78pg/ml。洗板3次，加入稀釋好的酶標(biāo)抗體，100l/孔，37，1h。洗板3次，加入配好的ABTS顯色液，100l/孔，室溫或37顯色1530min。ELISA讀數(shù)儀測(cè)450nm/650nm處OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。    1.4.2  Wetern blot(

15、蛋白質(zhì)印跡)  將RAW264.7細(xì)胞用鈦顆粒處理后，置于含有酶抑制劑的細(xì)胞溶解緩沖液(150mmol/L NaCl、1NP-40、0.5去氧膽酸及50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)中，室溫下1h，離心10min(13000r/min)，取上清液，檢測(cè)蛋白濃度。將同一蛋白濃度的待測(cè)標(biāo)本、陽性對(duì)照及陰性對(duì)照樣本煮沸3min，分別加入4%15% 十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠，電泳4560min(電壓200V)。將帶有蛋白帶的凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，在90V電壓下轉(zhuǎn)移1h，將其置于5%無脂牛奶中1h(

16、去除非特異性染色)后取出，加第1抗體-ERK/JNK/IkBa(抗體稀釋液：1%小牛血清、Tris鹽溶液、0.5 Tween 20)于硝酸纖維膜，4過夜，漂洗3次后加HRP標(biāo)記的抗1抗體，再置室溫1h，漂洗3次，用放射自顯影法顯影，Kodak X膠片攝影。Western blot方法顯示的蛋白帶密度直觀進(jìn)行比較。    1.4.3  EMSA(凝膠遷移率實(shí)驗(yàn))  Park方法準(zhǔn)備細(xì)胞核提取液8。蛋白濃度用BCA試劑盒測(cè)定。凝膠遷移測(cè)定方法按Promega 公司說明書

17、進(jìn)行。7g 核抽提液與1g poly d(I-C)含50，000100，000 cpm 32P標(biāo)記的AP-1/ NF-B置25g的結(jié)合緩沖液（10mM Tris.HCl, pH 7.5, 100mM NaCl, 1mM DTT, 和4% glycerol）于室溫30min。形成的復(fù)合物在0.5xTBE緩沖液(50mM Tris. HCl, pH8.5, 50mM borate,和1mM 

18、EDTA)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，并凝膠在真空中變干60min后 X 膠片攝影。    1.4.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  統(tǒng)計(jì)分析用SPSS11.0并完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析。P <0.05具有意義。    2  結(jié)果     2.1  鈦顆粒刺激后由時(shí)間及劑量依賴性釋放TNF-  為確定RAW264.7細(xì)胞在何有效濃度的鈦

19、顆粒才能釋放TNF-，選擇了三種不同濃度的鈦顆粒并與RAW264.7細(xì)胞混合。取其上清液用 ELISA法測(cè)定TNF-。圖1示三種濃度的鈦顆粒劑量依賴性釋放TNF- ，圖2示0.02% 濃度鈦顆粒刺激后時(shí)間依賴性釋放TNF-。    2.2  ERK/p38/JNK/NF-B 抑制劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞受鈦顆粒刺激而釋放的TNF-的效果  為了解RAW264.7細(xì)胞受鈦顆粒刺激而釋放TNF- 與哪支細(xì)胞信號(hào)通路有關(guān)，細(xì)胞先由ERK/p38/JNK/NF-B 

20、;抑制劑處理后，再受0.002%鈦顆粒刺激24h。用ELISA法測(cè)定其上清液中的TNF-。與對(duì)照組（651.5±9.3pg/ml)相比，30M PD98059, 25M SB203580, 20M SP600125, and 10M MG132 各抑制TNF-  66% (218.2±21.1pg/ml), 20% (550±5pg/ml), 91% (56±6pg/ml) and

21、60;92% (51.3±4.7pg/ml) (P<0.01) (見圖3) 。其中JNK抑制劑（SP600125）及NF-B 抑制劑（MG132）顯示較強(qiáng)的抑制作用。圖3  ERK1/2、JNK及NF-B抑制劑對(duì)RAW264.7  細(xì)胞受鈦顆粒刺激而釋放的TNF-的效果2.3  鈦顆粒誘導(dǎo)的JNK/AP-1及NF-B 通道活化的效果  為了解鈦顆粒誘導(dǎo)的TNF- 釋放的分子生物學(xué)機(jī)制，我們用磷酸化ERK/JNK特異性抗體檢測(cè)了MA

22、P 激酶。并且，測(cè)定IkB 來了解 NF-B 的活性。當(dāng)鈦顆粒刺激15min 后，誘導(dǎo)磷酸化的ERK。磷酸化的JNK 受刺激1h 后達(dá)高峰，隨后下降。IkBa受刺激15min 后降解而1h后最顯著（見圖4）。眾所周知，活化的JNK可以c-JUN 磷酸化，繼而活化AP-1 轉(zhuǎn)錄因子9 。為確定鈦顆粒誘導(dǎo)的TNF- 釋放與AP-1/NF-B活化有無相關(guān)，RAW264.7細(xì)胞受鈦顆粒處理并EMSA 方法測(cè)定。由鈦顆粒刺激15min及30min 后，明顯活化AP-

23、1/NF-B （見圖5）。總之，這些結(jié)果表明鈦顆粒誘導(dǎo)的TNF-釋放與調(diào)節(jié)下降與JNK/AP-1及NF-B 活性有關(guān)。   3  討論    人工關(guān)節(jié)術(shù)置換術(shù)后骨溶解及假體松動(dòng)的發(fā)病機(jī)制由顆粒碎片激活巨噬細(xì)胞并釋放TNF-等炎癥因子有關(guān)。降低這些炎癥因子來阻止假體周圍炎癥反應(yīng)的巨噬細(xì)胞，從而可以防止骨溶解。TNF-是免疫防御系統(tǒng)中主要的細(xì)胞因子，也是受顆粒刺激的巨噬細(xì)胞釋放的重要的介質(zhì)10，11 ，因此，它的合成將成為阻止顆粒誘導(dǎo)的骨溶解可能性目標(biāo)。  &

24、#160; 對(duì)受各種刺激而釋放TNF-已有很多研究。本研究中，證明了RAW264.7巨噬細(xì)胞株受鈦顆粒刺激后呈劑量及時(shí)間依賴性釋放TNF- （見圖1）。在TNF- 啟動(dòng)因子中包含AP-1/Ets/NFAT等不同的轉(zhuǎn)錄因子潛在的結(jié)合位。這些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)TNF- 基因活化起重要作用12 。其中，NF-B是誘導(dǎo)TNF- 研究較多的轉(zhuǎn)錄因子之一13，14 。而AP-1或其他轉(zhuǎn)錄因子可能與TNF- 表現(xiàn)有關(guān)15 。實(shí)際上，RAW264.7細(xì)胞受鈦顆粒刺激后誘導(dǎo)JNK/ERK及IkB降解等信號(hào)分子活性（見圖4）。與此結(jié)

25、果相似，JNK及NF-B藥物性抑制劑相當(dāng)程度上減少鈦顆粒刺激而釋放的TNF- （見圖3）。然而，我們認(rèn)為JNK 磷酸化Jun 后活化AP-1是RAW264.7細(xì)胞受鈦顆粒刺激而活化的（見圖4）。因此，我們?cè)噲D是否RAW264.7細(xì)胞受鈦顆粒刺激后AP-1被激活。與我們預(yù)期一樣，AP-1 被鈦顆粒迅速激活,而且,同時(shí)激活NF-B（見圖5）。由此，我們可以肯定RAW354.7細(xì)胞受鈦顆粒刺激產(chǎn)生TNF-與JNK/AP-1及NF-B通道有關(guān)。    4  結(jié)論   

26、60;此項(xiàng)研究首次證明了鈦顆粒誘導(dǎo)的TNF- 釋放不僅與NF-B通道有關(guān),而且與JNK/AP-1通道有關(guān)。因此，我們認(rèn)為阻止這些通道將對(duì)人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后產(chǎn)生的骨溶解及假體松動(dòng)具有預(yù)防及治療作用。 【參考文獻(xiàn)】  1 Archibeck MJ, Jacobs JJ, Roebuck KA, et al. The basic science of periprosthetic osteolysis. Inst

27、r Course Lect, 2001，50:185-195.2 Mirra JM, Marder RA, Amstutz HC.The pathology of failed total joint arthroplasty. Clin Orthop Relat Res，1982，175-83.3 Al-Saffar N, Khwaja HA, Kadoy

28、a Y,et al. Assessment of the role of GM-CSF in the cellular transformation and the development of erosive lesions around orthopaedic implants. Am J Clin Pathol,1996, 105:

29、628-639.4 Kim KJ, Rubash HE, Wilson SC, et al. A histologic and biochemical comparison of the interface tissues in cementless and cemented hip prostheses. Clin Orthop Rel

30、at Res,1993,142-152.5 Kimble RB, Srivastava S, Ross FP,et al. Estrogen deficiency increases the ability of stromal cells to support murine osteoclastogenesis via an interleukin-1and tumor necrosis factor-mediated stimulation of macrophage colony-stimulating factor production. J Biol&