蛋白質(zhì)的定量測(cè)定Folin-酚法ppt課件

1、蛋白質(zhì)的定量測(cè)定蛋白質(zhì)的定量測(cè)定Folin-酚法酚法 1學(xué)習(xí)Folin酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法；2制備規(guī)范曲線，測(cè)定未知樣品中蛋白質(zhì)含量。 Folin酚試劑由甲試劑和乙試劑組成。甲試劑由碳酸鈉，氫氧化鈉，硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下，與酒石酸鉀鈉銅鹽溶液起作用，生成紫紅色絡(luò)合物。乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸，硫酸，溴等組成。此試劑在堿性條件下，易被蛋白質(zhì)中酪氨酸的酚基復(fù)原呈藍(lán)色反響，其色澤深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法也適用于測(cè)定酪氨酸和色氨酸的含量。 一、試劑Folin酚試劑:試劑甲：1) 4%碳酸鈉溶液2) 0.2mol/L氫氧化鈉溶液3) 1%硫酸銅溶液4) 2%酒

2、石酸鉀鈉溶液。 臨用前將1與2等體積配制碳酸鈉氫氧化鈉溶液。3與4等體積配制成硫酸銅酒石酸鉀鈉溶液。然后這兩種試劑按50:1的比例配合，即成Folin酚試劑甲。此試劑臨用前配制，一天內(nèi)有效。 試劑乙： 稱鎢酸鈉Na2WO22H2O100g，鉬酸鈉Na2MoO42H2O25g置2000ml磨口回流安裝內(nèi)，加蒸餾水700ml，85%磷酸50ml和濃硫酸100ml。充分混勻，使其溶解。小火加熱，回流10h燒瓶?jī)?nèi)加小玻璃珠數(shù)顆，以防溶液溢出，再參與硫酸鋰LiSO4150g，蒸餾水50ml及液溴數(shù)滴。在通風(fēng)櫥中開口煮沸15min，以除去多余的溴。冷卻后定容至1000ml，過濾即成Folin酚試劑乙儲(chǔ)存液

3、，此液應(yīng)為鮮黃色，不帶任何綠色。置棕色瓶中，可在冰箱長(zhǎng)期保管。假設(shè)此儲(chǔ)存液運(yùn)用過久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸幾分鐘，恢復(fù)原色仍可繼續(xù)運(yùn)用。二、規(guī)范蛋白質(zhì)溶液二、規(guī)范蛋白質(zhì)溶液1. 規(guī)范蛋白質(zhì)溶液規(guī)范蛋白質(zhì)溶液 結(jié)晶牛血潔白蛋白或酪蛋白，預(yù)先經(jīng)結(jié)晶牛血潔白蛋白或酪蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度配制成純度配制成250ug/ml蛋白溶液蛋白溶液三、器材三、器材試管及試管架；試管及試管架；0.5,1,及及5ml移液管，恒溫水移液管，恒溫水浴，分光光度計(jì)。浴，分光光度計(jì)。一、制造規(guī)范曲線一、制造規(guī)范曲線取試管，按下表操作：取試管，按下表操作：A 試管編號(hào)試劑處理123456未知樣品標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液/ml00.20.40.60.81.01.0蒸餾水/ml1.00.80.60.40.200Folin-酚甲試劑/ml5.05.05.05.05.05.05.0搖勻，于2025放置10minFolin-酚乙試劑/ml0.50.50.50.50.50.50.5迅速搖勻，室溫2025水浴保溫30min，在500nm*處比色500 (1) Folin-酚乙試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而Folin酚甲試劑是在堿性條件下與蛋白 質(zhì)作用生成堿性的銅蛋白質(zhì)溶液。當(dāng)Folin酚乙試劑參與后，應(yīng)迅速搖勻加一管搖一管，使復(fù)原反響