現(xiàn)代藥物分析技術(shù)綜述

1、毛細(xì)管電泳技術(shù)在手性藥物分析中的應(yīng)用摘要:手性藥物的分離近年來越來越引起世界各國的普遍關(guān)注。這是由于手性藥物引入人體,其對映異構(gòu)體由人體內(nèi)的手性受體、酶及蛋白以兩個(gè)完全不同的分子處理,各個(gè)對映異構(gòu)體在生物環(huán)境中表現(xiàn)出藥物效應(yīng)的種類和強(qiáng)度不同以及藥物吸收、分布、代謝、排泄等方面存在立體選擇性差異。對映體的一個(gè)可能是有效成分,而另一個(gè)則可能是低效無效甚至有毒。因此,開發(fā)和研究有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的手性對映體的拆分技術(shù)以用于醫(yī)藥質(zhì)量控制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。氣相色譜法(GC和高效液相色譜法(HPLC已成功用于許多對映體的拆分制備與純度測定,而毛細(xì)管電泳(CE作為二十世紀(jì)80年代才逐漸興起的一種分離分析技術(shù)已

2、逐步在藥物、生物大分子、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。由于CE分離效率高、分離模式多、低耗、快捷簡便等優(yōu)點(diǎn),因而在手性分離中具有諸多優(yōu)勢,它與GC、HPLC相互補(bǔ)充,顯示了巨大的應(yīng)用潛力,有望成為分離分析手性化合物最為有效和最簡便經(jīng)濟(jì)的方法。手性拆分有直接拆分和間接拆分兩種形式。直接拆分是指在手性環(huán)境下對對映體的直接分離;間接拆分是指先將對映體與手性光學(xué)試劑反應(yīng),生成非對映異構(gòu)體之后再進(jìn)行分離。關(guān)鍵詞:毛細(xì)管電泳技術(shù)手性藥物藥物分析1.前言:毛細(xì)管電泳技術(shù)確實(shí)具備特點(diǎn),其主要者有:( 1 因毛細(xì)管可有效散熱而可施以高強(qiáng)度電場,C E的分離、分析是高效而快速的;( 2 樣品用量極少,僅需條件

3、u L至n L,耗用試劑量少;( 3 不用支持基質(zhì)的FSCE 法可避免樣品與基質(zhì)的作用,有利于保持生物活性;( 4 與傳統(tǒng)凝膠電泳相比,省略鑄膠、染色、干燥等許多操作,實(shí)驗(yàn)效率大大提高,電泳系統(tǒng)構(gòu)成了“一休化”的電泳儀;( 5 實(shí)現(xiàn)在線檢測后重現(xiàn)性和定量粘度優(yōu)于傳統(tǒng)電泳,在某些方面可與HPLC互為補(bǔ)充,提供正交結(jié)果,甚至取而代之。正因?yàn)榫邆湓S多優(yōu)點(diǎn),CE獲得了迅速的發(fā)展。有人譽(yù)之為電泳技術(shù)的“新紀(jì)元”。然而,應(yīng)該說CE仍處于繼續(xù)成長的階段。例如:分離條件的標(biāo)準(zhǔn)化,能改善定量測定重現(xiàn)性的最佳進(jìn)樣方式,怎樣使分析系統(tǒng)發(fā)展為制備系統(tǒng),高靈敏檢測手段的實(shí)用化,以及應(yīng)用領(lǐng)域的繼續(xù)擴(kuò)展等等,均有待進(jìn)一步解

4、決。如果這些問題能逐步解決,則CE將如GC、HPLC等微量分析方法那樣,成為一種可普遍推廣的實(shí)用的常規(guī)分離和分析手段。國內(nèi)對CE的研究和應(yīng)用,已引起注意,但起步較晚。有些單位已引進(jìn)或即將引進(jìn)國外的儀器,似應(yīng)加緊使用,并盡量擴(kuò)大應(yīng)用領(lǐng)域,積累經(jīng)驗(yàn)。少數(shù)單位已著手自行制作,或購買國外部分部件自行裝配實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)開展工作,這是值得提倡的。須知國外許多大學(xué)實(shí)驗(yàn)室或研究所的CE先行者,都在自己制作的實(shí)驗(yàn)系長統(tǒng)上做出成果。如能充分利用引進(jìn)的和自制的儀器,加上國內(nèi)的科技工作者能通過適當(dāng)?shù)那篮瓦m當(dāng)?shù)男问郊訌?qiáng)交流,密切協(xié)作,深信我國的毛細(xì)管電泳技術(shù)必能迎頭趕上,在這一新興技術(shù)領(lǐng)域的國際舞臺上占有一席之地。藥物的不

5、同手性異構(gòu)體往往具有不同的藥效、毒性和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)。制藥的發(fā)展趨勢是開發(fā)單一手性異構(gòu)體藥物,而目前多數(shù)藥物為外消旋體混合物。同一藥物的兩種手性異構(gòu)體,其理化性質(zhì)幾乎完全相同,這給手性藥物的分離帶來了很大困難。不過,手性分離可以借鑒HPLC手性分離的一些策略用手性試劑同藥物反應(yīng)產(chǎn)生非對映異構(gòu)體而分離在流動(dòng)相中引入手性添加劑造成手性環(huán)境進(jìn)行分離用手性固定相進(jìn)行分離。在CE中不用固定相,因此只能引用前兩種方法,其中以CE底液中加入手性添加劑進(jìn)行手性分離研究的較多?？傊?因其分離效率很高(理論塔板數(shù)可達(dá)百萬,用于手性分離有廣闊的前景。同HPLC 手性分離相比,它具有手性添加劑用量少、不用手性柱等特點(diǎn)。2

6、. 毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE及各類手性選擇劑CZE又稱毛細(xì)管自由電泳,是CE中最基本最普遍的一種模式。各類手性選擇劑加入緩沖液中可實(shí)現(xiàn)多種手性異構(gòu)體的分離,且機(jī)理也各不相同。2.1 環(huán)糊精類化合物及其衍生物環(huán)糊精(cyclodextrin,CD及其衍生物是最重要的一類手性選擇劑,CD是用CD酶處理淀粉得到的化合物,目前已分離出的六聚、七聚和八聚體分別稱為:-,-,-CD。組成CD的每個(gè)葡萄糖單元均含5個(gè)手性碳原子,因此對對映異構(gòu)體有較好的選擇性。手性選擇劑CD是由多個(gè)吡喃葡萄糖單元以1,4-糖苷鍵首尾相連形成的環(huán)狀低聚糖,其分子具有中空的圓臺狀結(jié)構(gòu),空腔內(nèi)相對疏水,其促使對映體分離的基本原理是在

7、它們之間形成包合物。而不同包合物的穩(wěn)定常數(shù)不同,從而導(dǎo)致分離包合物的穩(wěn)定性主要決定于對映體分子的大小、極性與CD疏水空腔的匹配程度以及CD外緣的羥基與手性分子形成氫鍵的作用力的大小。在3種天然的-,-,-CD中,-CD的應(yīng)用最為廣泛?？赡苁怯捎谄淇涨慌c大部分對映體相匹配,而且-CD易獲得。當(dāng)CD外緣的羥基衍生化后,可以增大其水溶性,且空腔尺寸與物化性質(zhì)也有所改變。衍生化后若CD外緣帶有不同取代基,則手性選擇性增強(qiáng);若衍生化取代基帶電荷,則產(chǎn)生的靜電作用也可使手性識別能力有所增強(qiáng)。韋壽蓮等在以氧氟沙星、撲爾敏、特布它林和普萘洛爾為手性藥物,分別采用羥丙基-環(huán)糊精(HP-CD 、羥丙基- 環(huán)糊精結(jié)

8、合羧甲基- 環(huán)糊精(HP-CD/CM-CD作手性拆分試劑,考察環(huán)糊精濃度和pH對手性選擇性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)糊精提供手性相互作用,而pH強(qiáng)烈地影響這種相互作用。2.2 冠醚冠醚是另一類能形成主客體配合物的拆分劑,其手性拆分主要是基于冠醚環(huán)上處于不同位置的羥基與手性對映體(主要是胺類化合物存在氫鍵作用所致。對于無紫外吸收的伯胺類手性化合物可用手性冠醚作添加劑直接進(jìn)行分離后,再用間接UV 檢測方法檢測,無須衍生。冠醚不但能溶于親水性溶劑,也能溶于疏水性溶劑如苯、氯仿等,因而可將其作為非水CE的手性選擇劑用于手性分離。2.3 蛋白質(zhì)生物蛋白分子與藥物分子相互作用的立體選擇性一直深受人們的重視。蛋白質(zhì)

9、已成功用于CE手性分離。可作手性選擇劑的蛋白質(zhì)有:牛血清蛋白(BSA、人血清蛋白(HAS、卵粘蛋白、纖維素酶、伴清蛋白、-酸性粘蛋白等。蛋白質(zhì)作為手性選擇劑易產(chǎn)生兩個(gè)問題: (1蛋白質(zhì)本身的紫外吸收將引入背景吸收值,從而影響檢測靈敏度。解決方法:管壁吸附可通過管壁涂層、加入添加劑和采用高強(qiáng)場等方法解決。紫外吸收可于280 nm下檢測來改善。(2重現(xiàn)性差。余麗寧等用人血清白蛋白分離了馬來酸曲美布汀對映體。采用柱涂層技術(shù)可降低蛋白質(zhì)在毛細(xì)管壁上的吸附,使峰形和分離重現(xiàn)性得到明顯改善。在以蛋白質(zhì)為手性選擇劑的對映體分離中通過加入有機(jī)添加劑,調(diào)節(jié)對映體與蛋白質(zhì)間的疏水作用,可提高手性分離的選擇性,并改

10、善峰形。另外,除上述將蛋白質(zhì)作為選擇劑加入到緩沖液中,還可將其鍵合到凝膠、硅膠或CD上用于手性分離,作手性選擇劑的最大缺點(diǎn)是重現(xiàn)性差。近來人們探索將蛋白質(zhì)鍵合到7 Lm的硅膠上,在此條件下分離了安息香類鎮(zhèn)定劑和去甲羥基安定。用纖維素酶進(jìn)行手性拆分的研究報(bào)道較少,尚處于探索階段,也有將其填充到毛細(xì)管柱內(nèi)以電色譜形式進(jìn)行手性分離。2.4 大環(huán)抗生素大環(huán)大分子抗生素是近年來運(yùn)用并發(fā)展起來的一種非常有效的新型手性選擇劑?？股鼐哂惺中源蟓h(huán)狀結(jié)構(gòu),與對映體可產(chǎn)生氫鍵、靜電、疏水包合等作用從而實(shí)現(xiàn)手性分離。大環(huán)抗生素或多或少都具有紫外吸收,為避免其對檢測的影響,通常使用濃度都在5nmol/L以下。新霉素屬

11、于氨基糖苷類抗生素,它是由新霉素B和新霉素C(質(zhì)量比8515組成的混合物,由于新霉素具有易溶于水、紫外吸收低等優(yōu)點(diǎn),因此作為手性選擇劑分離手性化合物具有很大的潛力。2.5 多糖類化合物對多糖類化合物用作CE手性選擇劑進(jìn)行研究,得出緩沖液的pH與手性選擇劑的濃度是影響拆分的主要因素。麥芽糖糊精是常用的手性選擇劑,它是D-葡萄糖以1,4-糖苷鍵相聯(lián)接的線形低聚糖。離子型粘多糖選擇劑有肝素、硫酸軟骨素、硫酸右旋糖苷等,對于離子型溶質(zhì),肝素是首選的手性選擇劑。2.6 離子絡(luò)合物將金屬離子Cu、Ni、Zn等離子和手性氨基酸形成三元金屬離子絡(luò)合物作為手性選擇劑,對映體與此絡(luò)合物中的一個(gè)手性氨基酸進(jìn)行配體交

12、換形成新絡(luò)合物從而實(shí)現(xiàn)分離。此法常用于拆分氨基酸對映體、擬交感神經(jīng)等藥物的分離。利用手性選擇性金屬絡(luò)合物對于單一的異構(gòu)體分離,簡單方便,并且有良好的分離效果。但用于分離不同種類異構(gòu)體的混合物時(shí),分析的效果顯得不夠理想。3. 非水毛細(xì)管電泳(NACE非水毛細(xì)管電泳(NACE是近幾年才發(fā)展起來的毛細(xì)管電泳的一個(gè)分支,由于它有優(yōu)于傳統(tǒng)水相毛細(xì)管電泳的許多特點(diǎn),因此廣泛的應(yīng)用于手性化合物的分離分析工作中。由于有機(jī)溶劑與水的物理、化學(xué)性質(zhì)的不同,導(dǎo)致分離條件和分離機(jī)理的改變,因此對NACE分離機(jī)理的研究是十分有必要的。在非水毛細(xì)管電泳中,有兩種策略可以實(shí)現(xiàn)手性的分離。一是手性消除。即讓對映異構(gòu)體與手性試

13、劑進(jìn)行化學(xué)反應(yīng),可以使之轉(zhuǎn)變成非對應(yīng)異構(gòu)體。二是構(gòu)建手性分離環(huán)境,就是將手性分析物加到毛細(xì)管電泳的緩沖溶液中就可以構(gòu)建出不同的手性環(huán)境。后一種方法高效快速,富于變化,并且不傷害樣品。已經(jīng)被普遍采用。手性環(huán)境的構(gòu)建通常有三種方法:1.使用手性添加劑;2.使用手性填充毛細(xì)管;3.使用手性涂層毛細(xì)管。由于手性填充和手性涂層毛細(xì)管需要特別的制作技術(shù),執(zhí)行起來有一定的難度,而添加劑法只需要向電泳緩沖液中加入合適的手性試劑,經(jīng)過一定的分離條件優(yōu)化即能實(shí)現(xiàn)手性分離,是一種簡單實(shí)用的方法。目前對NACE 還僅僅是停留在摸索應(yīng)用的階段,對其具體的分離機(jī)理的研究還很少,開發(fā)前景較大。4.小結(jié)手性藥物的生物活性與其

14、立體構(gòu)型密切相關(guān)。目前新藥研究的一個(gè)發(fā)展趨勢是研制和生產(chǎn)光學(xué)純的藥物。手性藥物的研究已成為國際新藥研究的新方向之一,手性藥物分析在手性藥物研究中作用越來越重要,已成為國際上分析科學(xué)中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前在手性藥物分析中主要采用間接分析和直接分析。直接分析簡便、快速、準(zhǔn)確和可靠,其中HPLC法如今占主導(dǎo)地位,毛細(xì)管電泳法呈上升趨勢。毛細(xì)管電泳是近20年來迅速發(fā)展起來的一種高效、快速、微量的分離分析方法。在毛細(xì)管電泳手性分析中,一般是將手性選擇劑(又稱手性添加劑加入到分離緩沖液中,提供一個(gè)手性環(huán)境,由于一對對映體與手性選擇劑的作用強(qiáng)弱有差異,導(dǎo)致各自不同的電泳淌度,從而達(dá)到手性分離。CE在手性拆分中

15、具有明顯的優(yōu)勢,由于樣品用量小、分離效率高、分離速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),在手性藥物分離分析中日益受到人們的關(guān)注。隨著技術(shù)的發(fā)展和各種手性選擇劑的不斷開發(fā),手性分離技術(shù)的不斷完善,CE在手性藥物的拆分、手性對映體的鑒別、藥物光學(xué)雜質(zhì)的測定、體內(nèi)藥物手性分析及定量分析方法研究等方面將具有更加廣闊的發(fā)展前景。毛細(xì)管電泳目前基本靠重力進(jìn)樣,因此進(jìn)樣量不好控制,重現(xiàn)性、穩(wěn)定性不好是CE的弱點(diǎn)。參考文獻(xiàn)： 1. 韋壽蓮， 鄧光輝 手性藥物的毛細(xì)管電泳拆分J 分析測試學(xué)報(bào)， 2007， 26(6： 907-910 2. 王志，孫亦梁，孫曾培高效毛細(xì)管電泳分離手性物質(zhì)J分析測試學(xué)報(bào)，1996，(2： 85-9

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