疏水層析填料

1、2008-6Volume 8疏水層析填料疏水層析，是根據(jù)不同的蛋白與疏水表面產(chǎn)生的相互作用的差異，進(jìn)行蛋白分離的一種方法。一般而言，離子強度（鹽濃度）越高，物質(zhì)所形成的疏水鍵越強。影響疏水作用的因素包括：鹽濃 度，溫度，pH ,表面活化劑和有機溶劑。疏水層析的應(yīng)用與離子交換層析的應(yīng)用剛好互補，因此， 可以用于分離離子交換層析很難或不能分離的物質(zhì)。Chisso公司生產(chǎn)的疏水層析填料，有三種類型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl ,分別為在多孔的交聯(lián)纖維素顆粒上通過一個短接頭，共價鍵和丁基，苯基或者辛基的層析填料。結(jié)構(gòu)見下 圖：填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性

2、程度依次增大。通常， Cellfine TM Octyl對疏水性 蛋白的吸附性會強于Cellfine TM Butyl對疏水性蛋白的吸附。然而，蛋白被吸附的越厲害，也就越 難洗脫。Cellfine TM Phenyl ,具芳香族物質(zhì)的特性，因此，在某些情況下，可以更好地吸附丁基和 辛基等脂肪族所不能吸附的物質(zhì)。在使用疏水層析分離物質(zhì)時，沒有通法，只能根據(jù)待分離物質(zhì)的 特性，篩選合適的填料，摸索優(yōu)化其分離純化的條件。三種疏水層析填料的疏水性差異（左圖）色譜柱：8.2 x 150 mm柱體積：8 ml流動相：2.0 - 0.0MAmmonium Sulfatein 0.01M phosphate,

3、pH 7.0流速：1.32 ml/min樣品：5 mg/3 ml - 100 pl2008-6 Volume 8Asahipak NH2P色譜柱（氨基柱）Asahipak NH2PAsahipak NH2P 色譜柱是Shodex公司生產(chǎn)的用于分析糖類物質(zhì)的正相柱 色譜柱，是以聚合物為基材的氨基柱，化學(xué)穩(wěn)定性良好，在 pH2-13的條件下均可使用。與硅膠基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P ,可以很好地實現(xiàn)硅膠基材氨基柱的各種應(yīng)用；對流動相的耐受性更好，使用壽命更長久；另外， Asahipak NH2P可用于定量分析；還可以用堿性溶劑沖洗3 iIi ca based a

4、m i no ooIumnF i rst useWI2P-&0 4EFirst usenftsr 1 Bohrs1 Fructow3 2- Giuua*用而unfintmL)Time (hr)聚合物基材氨基柱與硅膠基材氨基柱的柱壽命比較左圖為 Asahipak NH2P 色譜柱與硅膠基材氨基柱的壽 命對比試驗。結(jié)果顯示：隨著 使用時間的延長，硅膠基材氨 基柱對單糖、二糖的保留快速 下降，其原因應(yīng)是硅膠基材氨 基柱的氨基降解所致。色譜柱：Asahipak NH2P-504E,其它公司的氨基柱(4.6mmID*250mm)CH3CN/H2O=75/25流速：1.0mL/min檢測器：Sho

5、dex RI柱溫：30度Asahipak NH2P 色譜柱可在正相模式下分離糖類物質(zhì),糖類物質(zhì)按照分子量由小到大的順序依次被洗脫。增加洗脫液中有機溶劑的比例可以延遲糖類的洗脫時間AsahipakNH2P色譜柱可以在堿性，室溫條件下分離單糖、二糖和糖醇混合物。右圖為Asahipak NH2P 色譜柱分離單糖、二糖及三 糖混合物的應(yīng)用實例。單糖、二糖及三糖混合物的分離b Fructose c. Glucose d Sucrose e Mallo»e f.色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4.6mmID*250mm)流動相：H2O/CH3CN=25/75流速：

6、1.0mL/min檢測器：Shodex RI柱溫：30度2008-6 Volume 8學(xué)習(xí)園地導(dǎo)致色譜柱柱壓升高的原因及解決方案第一階段：確認(rèn)是柱子導(dǎo)致的壓力上升，還是 HPLC系統(tǒng)導(dǎo)致的壓力上升。由于HPLC系統(tǒng)有很多環(huán)節(jié)，如泵、管路等，都容易吸附和積聚雜質(zhì)，這些因素均會導(dǎo)致壓力上升，所以，應(yīng)先對HPLC系統(tǒng)進(jìn)性排查。排查方法：取下色譜柱，僅用管路連接并正常輸送流動相時記錄系統(tǒng)壓力。如果此時HPLC系統(tǒng)壓力正常，則考慮是柱壓升高第二階段：確定是否使用了保護(hù)柱（預(yù)柱）。一般在測定容易堵塞色譜柱的樣品時，應(yīng)該使用保護(hù)柱。如果使用了保護(hù)柱，那么壓力的升高 就有可能是保護(hù)柱的柱壓升高導(dǎo)致的。排查方法

7、：取下色譜柱，僅以保護(hù)柱連接管路并正常輸送流動相測試柱壓，再反過來取下保護(hù) 柱僅以色譜柱連接管路正常輸送流動相測試柱壓，如果僅當(dāng)連接保護(hù)柱時柱壓高的話，則為保護(hù)柱 引起的柱壓升高，請清洗、或更換保護(hù)柱。第三階段：如果不是上述第一、第二點原因造成壓力升高，就可以確認(rèn)是色譜柱的原因了。如果柱壓是隨著使用時間的延長，慢慢上升，這屬于正常現(xiàn)象，是色譜柱達(dá)到使用壽命了，只 能更換色譜柱了。如果柱壓是在實驗開始時，實施中或經(jīng)過一次、幾次實驗后，突然上升，則要結(jié)合實驗情況考 慮以下因素：原因解決方案色譜柱柱長色譜柱越長，柱壓越高?？筛鶕?jù)實驗情況適當(dāng)減小柱長。柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑越小，柱壓越高?？蛇x擇大內(nèi)徑色譜柱。填

8、料基質(zhì)的形態(tài)填料的形態(tài)也會對柱壓有影響。硅膠基質(zhì)的形態(tài)可以分為無定形和球形兩種，現(xiàn)在一般裝柱使用球形硅膠。顆粒大小小粒徑填料裝填的色譜柱柱壓較高，在不影響分離效果的同時，可選擇大粒徑的填料。填料合成條件及裝柱條件不同 家生產(chǎn)的色譜柱有的柱壓可能相差 4、5個MPa, 特別是低端和高端色譜柱之間，這一區(qū)別比較明顯。例如： YMC公司生產(chǎn)的色譜柱，就屬于圖效圖壓型的。流動相流動相的前處理流動相中存在的雜質(zhì)也會堵塞色譜柱，引起柱壓升高。因止匕，在實驗前應(yīng)進(jìn)行必要的試劑前處理，包括濾膜過濾，用固相萃取方法去除容易吸附于色譜柱填料的強疏水性雜質(zhì)。流動相的種類/、同流動相，因其埋化性質(zhì)差異，產(chǎn)生的柱壓有所

9、差異。例如：乙睛產(chǎn)生的壓力低于甲醇，但兩者的分離效果相似。在某些情況下，可以通過替換流動相的種類減小柱壓?；旌狭鲃酉嗟谋壤鲃酉喑煞珠g的比例，也可以引起柱壓的差異。如：當(dāng)甲醇/水=50/50 時，柱壓就較高?？梢酝ㄟ^調(diào)整流動相成分間的比例降低柱壓。溫度溫度的變化也會導(dǎo)致柱壓的變化。最好使用柱溫箱控溫，可根據(jù)實驗情況，適當(dāng)升高柱溫以減小柱壓。樣品含后/、溶性成分過濾樣品，充分離心，防止堵塞預(yù)柱及色譜柱，引起柱壓升高。鹽分樣品或緩沖液中的鹽分結(jié)晶于柱內(nèi)，也可引起柱壓升高。如：乙酸俊。根據(jù)實驗情況，清洗色譜柱中的鹽分，從而 降低柱壓。如：先用 4050 C的純水，低速正向沖洗 柱子，待柱壓逐漸下降后

10、，相應(yīng)提高流速沖洗，柱壓大幅 度卜降后，用常溫純水沖洗，之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘。被填料吸附沉積樣品污染沉積也會導(dǎo)致柱壓升高。須根據(jù)實驗情況和柱子類型進(jìn)行清洗。（常規(guī)的清洗方法如下。）常規(guī)的色譜柱清洗方法（正向沖洗）使用比目前使用的流動相對樣品溶解能力更強的試劑清洗色譜柱。 如果您使用的流動相是乙腈：水（70:30 ） ， 請使用更高濃度的乙腈水溶液進(jìn)行清洗， 比如乙腈： 水（80:20 ） 或乙腈： 水（90:10 ）但是，如果高濃度的乙腈水溶液導(dǎo)致樣品溶解困難的話，請停止使用上述流動相，轉(zhuǎn)而使用對樣品易溶的流動相。如果該方法仍不見效，請試用下述方法。色譜柱清洗方法（反向沖洗）將色譜柱反向連接（即與色譜柱上箭頭標(biāo)識相反的方向使流動相由出口處流入、入口處流出）輸送流動相試試。此時，如果柱壓太高會對色譜柱造成損壞，所以請將流速調(diào)至平時操作時的一半。但是，如果使用相同的流速，反洗比正向清洗柱壓還低的話，可能會發(fā)生色譜柱入口處的填料在篩板處聚