哮喘老鼠肺組織表達的影響

1、哮喘老鼠肺組織表達的影響     本文作者：孫妍 王金榮 韓秀珍 李化兵 孫立鋒 陳星 馮益真 單位：山東大學附屬省立醫(yī)院兒科 山東省諸城市人民醫(yī)院兒科哮喘是一種由多種炎癥細胞參與的氣道慢性炎癥性疾病，許多細胞因子參與致病，發(fā)病機制不明。哮喘雖可以控制，但慢性炎癥持續(xù)存在，從而導致在多種細胞因子共同作用下，最終發(fā)生不可逆性氣道重塑，加重氣流阻塞和氣道高反應性。另外血管生成也參與氣道重塑，降低氣道順應性。血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)具有促進內皮細胞增殖、增加微血管通透性、促進血管生成和成熟的功

2、能1，且VEGF參與哮喘氣道重塑中平滑肌細胞增殖2。缺氧誘導因子-1(hy-poxiainduciblefactor1，HIF-1)是近年發(fā)現的普遍存在于哺乳動物細胞內的缺氧應答調控因子，可調控VEGF等基因表達，在哮喘信號轉導中有重要作用3-4。本實驗旨在通過研究布地奈德吸入對慢性哮喘小鼠血管生成、氣道重塑的影響及HIF-1、VEGF表達的調控，探討布地奈德對于哮喘氣道重塑的作用機制。1材料與方法11材料雌性BALB/c小鼠30只，體重20±2g左右，由山東大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。卵清蛋白(OVA)購于美國Sigma公司;小鼠抗HIF-1、VEGF抗體及-actin多克隆抗體均

3、購于美國SantaCruz公司;兔抗小鼠vonWillebrandfactor(vWF)抗體購自GeneTech公司;免疫組化檢測試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司;HRP標記羊抗小鼠二抗購自DakoCytomation公司;超聲霧化器由BestnebNebuliier公司提供。12動物分組及模型建立采用隨機數字表法將30只小鼠隨機分為對照組、模型組和治療組，每組10只。模型組小鼠第1天和第14天腹腔注射含100gOVA與1mg氫氧化鋁的磷酸鹽緩沖PBS溶液02mL各1次;第21天開始每天霧化吸入含2%OVA的PBS溶液1次，每次激發(fā)30min。OVA激發(fā)后，小鼠出現煩躁不安、嗆咳、呼吸加

4、快及四肢癱軟等癥狀，視為激發(fā)成功，并持續(xù)霧化吸入。治療組小鼠在按模型組方案處理同時，第28天開始每日霧化吸入布地奈德100g/kg，之后1h給予霧化吸入含2%OVA的PBS溶液30min。對照組同時間點給予PBS腹腔注射及霧化刺激。13標本采集末次激發(fā)后24h，采用1%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉后處死動物。取部分肺組織置于10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，5m連續(xù)切片，病理切片用于免疫組化和蘇木精伊紅(HE)染色、Masson染色。光鏡下觀察肺組織病理變化。部分肺組織置于液氮保存。14染色分析141HE染色HE染色按常規(guī)方法進行。每個標本選取4個直徑在100200m范圍內的不含

5、軟骨的完整氣管橫斷面行光鏡下形態(tài)學觀察，采用Image-proplus60圖像分析軟件進行測量，測定參數包括支氣管管壁內周長(Pi)、支氣管管壁外圍面積(WAt1)、支氣管管壁內圍面積(WAt2)，計算管壁總面積(WAt)=WAt1WAt2，以WAt/Pi(m2/m)表示支氣管管壁厚度5，并以此衡量氣道重塑程度。142Masson染色Masson染色后，膠原纖維呈綠色，肌纖維和紅細胞呈紅色，胞核呈藍色。膠原纖維沉積程度依據支氣管及血管周圍膠原沉積量分為4級:0級為無膠原或僅有少量細絲狀膠原;1級為膠原纖維輕度增多，呈細束狀;2級為膠原纖維中度增多，融合成細帶狀;3級為膠原纖維明顯增多，融合成寬

6、帶狀或小片狀。每個標本選取5個高倍視野，分別計算各組膠原沉積指數。15免疫組織化學染色及肺組織血管面積百分比計算石蠟切片脫蠟，枸櫞酸鈉緩沖液加熱沸騰進行抗原修復，室溫3%H2O2孵育15min，去除內源性過氧化物酶的活性。分別加HIF-1、VEGF及vWF一抗(1200)4濕盒過夜，加入生物素化二抗和SAB試劑，DAB顯色，PBS終止反應，蘇木素復染、透明、封片。細胞核或細胞漿光鏡下出現棕黃色產物者為陽性反應。PBS代替一抗作陰性對照。用LeicaOwin軟件分析血管生成情況，每個標本觀察5張切片，每張切片在顯微鏡下隨機選取10個視野，計算vWF-陽性反應的血管面積占視野的百分比，即肺組織血管

7、面積百分比。16Westernblot檢測每只小鼠取100mg肺組織，剪碎后加入蛋白酶抑制劑和細胞裂解液，超聲粉碎，4離心15min(15000r/min)，上清用BCA法測蛋白質濃度。等量蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，含5%BSA的TBS室溫封閉1h，然后加入HIF-1、VEGF抗體(1200)及-actin多克隆抗體，4搖床過夜。HRP標記二抗雜交，洗膜后化學發(fā)光并曝光成像，利用圖像分析系統(tǒng)掃描。-actin為內參照，靶蛋白/-actin相對吸光度值代表蛋白表達。17統(tǒng)計學分析采用SPSS115統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數±標準差(x±s)表示，多組間

8、比較采用One-wayANOVA檢驗和Mann-Whitney檢驗。相關性分析采用Spearman相關檢驗。P005為差異有統(tǒng)計學意義。2結果21各組肺組織氣管管壁厚度比較對照組小鼠肺組織氣道黏膜結構完整，上皮細胞無增殖，未見管壁水腫及明顯炎性細胞浸潤。模型組肺組織氣管黏膜上皮部分脫落，小氣道上皮復層化，管壁出現以淋巴細胞、巨噬細胞為主的炎性細胞浸潤，平滑肌增厚，支氣管黏膜皺襞顯著增多，部分突入管腔，氣管壁厚度較對照組顯著增加(179±05mvs111±04m，P001)。治療組炎性細胞浸潤和氣道黏膜結構損傷程度較模型組明顯減輕，氣管管壁厚度較模型組降低(141±

9、03mvs179±05m，P001)，但仍較對照組增加(140±03mvs111±04m，P001)。見圖12。22各組肺組織膠原沉積指數比較對照組氣道壁薄，黏膜結構完整，平滑肌無增殖，膠原染色著色淺，染色面積少，膠原主要分布于支氣管及血管周圍。模型組氣道壁明顯增厚，平滑肌增生肥厚，膠原染色著色重，染色面積大，支氣管黏膜下、血管壁及周圍、肺泡壁、肺間質均有膠原大量沉積，膠原沉積指數較對照組顯著增加(270±024vs060±026，P001)。治療組氣管管壁增生較模型組減輕，且膠原沉積也較模型組明顯減少(210±029vs270

10、77;024，P005)，但仍較對照組增加(210±029vs060±026，P001)。見圖34。23各組血管生成變化對照組小鼠血管管腔規(guī)則，血管面積百分比少。模型組小鼠肺組織血管明顯增多，多靠近氣道上皮表面，甚至完全位于上皮細胞內，血管結構異常，管腔不規(guī)則，血管面積百分比較對照組顯著增加(283%±090%vs042%±010%，P001)。治療組小鼠肺組織血管增生減少，血管面積百分比較模型組明顯減少(078%±014%vs283%±090%，P001)，但仍較對照組增加(078%±014%vs042%±010

11、%，P005)。見圖56。24各組HIF-1蛋白表達變化對照組小鼠HIF-1呈少量表達。模型組小鼠HIF-1表達增加，主要位于肺泡上皮細胞、支氣管上皮細胞。治療組小鼠HIF-1蛋白表達較模型組明顯減少(圖7)。Westernblot結果也證實，HIF-1蛋白表達量在模型組小鼠較對照組顯著增加(097±047vs032±012，P001)，治療組表達量較模型組明顯減少(088±041vs097±047，P005)，但仍較對照組增加(088±041vs032±012，P005)，見圖8。25各組VEGF蛋白表達變化對照組小鼠肺組織VEGF

12、少量表達。模型組表達明顯增多，主要位于氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞和血管內皮細胞。治療組小鼠霧化吸入布地奈德后，VEGF表達量較模型組明顯降低(圖9)。West-ernblot結果也證實VEGF蛋白表達在模型組小鼠較對照組顯著增加(208±030vs096±030，P001)，治療組表達量較模型組明顯減少(112±022vs208±030，P001)，但仍較對照組增加(112±022vs096±030，P001)。見圖8。26氣管管壁厚度、血管面積百分比與VEGF、HIF-1表達的相關性分析模型組和治療組氣管管壁厚度與HIF-1和VEG

13、F表達均呈正相關(r分別為0749和0779，均P001);血管面積百分比與HIF-1和VEGF表達也呈現正相關(r分別為0785和0693，均P001)。且HIF-1與VEGF蛋白表達亦呈顯著正相關(r=0641，P005)。3討論氣道重塑是慢性哮喘的重要病理特征。哮喘小鼠支氣管黏膜下、肺泡壁、肺間質膠原大量沉積，氣道壁明顯增厚，氣道阻力增加，從而肺纖維化進程加劇，最終導致肺功能降低。另外也有哮喘者肺組織血管生成增加的報道6。慢性哮喘肺組織血管生成增加能夠促進氣道平滑肌細胞、成纖維細胞增生、肥大及分泌功能，導致炎癥細胞浸潤增加，加重氣道壁增厚，在哮喘氣道重塑中具有重要意義。本研究肺組織病理分

14、析顯示，模型組較對照組小鼠氣道上皮細胞明顯增生，平滑肌增厚，膠原沉積增加，血管生成增加，氣管管壁明顯增厚;布地奈德吸入治療后，小鼠肺組織氣管管壁厚度、血管生成顯著減輕，膠原沉積明顯減少，并由此減輕氣流阻塞和持續(xù)性氣道高反應性，從而有效抑制氣道重塑。VEGF是血管生成最主要的調節(jié)因子之一7，能夠增加血管通透性，促進血管形成8-9和肺血管增殖10。本研究中模型組較對照組小鼠VEGF表達明顯增加，且VEGF表達與血管面積百分比呈正相關。哮喘發(fā)作時，肺組織缺氧嚴重，VEGF基因轉錄和mRNA穩(wěn)定性都顯著增加，不僅促進血管生成，同時作為促血管滲漏因子，通過增加哮喘氣道血管的滲透性，也促進各種炎癥細胞、血

15、漿成分滲出，加重局部氣道的炎癥反應，引起血管外基質的結構改變和間質水腫11。亦有VEGF參與哮喘氣道重塑平滑肌增殖的報道12。本研究顯示VEGF表達與氣管管壁厚度呈正相關，有促進氣道重塑的作用。布地奈德吸入后，膠原沉積和血管生成均受到抑制，氣管管壁厚度減少，VEGF表達顯著降低，可見VEGF是布地奈德抑制哮喘氣道重塑的重要作用因子。HIF-1是低氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內的轉錄因子，HIF-1決定HIF-1的活性13。哮喘發(fā)作期肺組織缺氧，缺氧狀態(tài)促使HIF-1轉錄增加、降解減少，氣道痙攣使支氣管壁平滑肌細胞機械張力增加，HIF-1蛋白表達上調14-15。作為低氧誘導基因轉錄信息傳遞的最主要途徑，HIF-1調控下游眾多基因如VEGF的轉錄和表達16。VEGF5'端增強子內存在HIF-1的結合位點HRE，低氧條件下，HIF-1與VEGF5'端增強子結合后，VEGF轉錄和表達增強，血管生成增加，使血液到達缺氧部位。注射HIF-1活性成分能誘導非缺血組織的血管生成17，證實HIF-1具有促血管生成作用。本研究結果顯示，HIF-1表達不僅與VEGF表達呈正相關，且與血管面積百分比、氣管管壁厚度亦呈正相關。模型組小鼠HIF-1蛋白表達增加，促進靶因子VEGF轉錄，血管生