GFAP啟動子與骨髓基質干細胞神經膠質分化的篩選(

1、GFAP啟動子與骨髓基質干細胞神經膠質分化的篩選 作者單位 100044 北京大學人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科通訊作者 姜保國 本課題受國家863計劃（2002AA205071），國家973重大基礎研究項目（2001cca01300）基金資助張培訓 姜保國 何湘君 趙富強 魏光如 張殿英 傅中國 張宏波摘要 目的 研究骨髓基質干細胞體外誘導分化，結合特異性GFAP啟動子控制的EGFP的表達來篩選誘導的骨髓基質干細胞。方法 構建報告載體pGFAP-EGFP, 原代培養(yǎng)的骨髓基質干細胞，在-ME, RA, forskolin, bFGF, PDGF-AA, HRG-等復合物的誘導7天后，pGFAP-EGFP載

2、體轉染，G418抗生素篩選。熒光顯微鏡下觀察存活細胞體內的EGFP表達情況，流式細胞儀測定熒光細胞的比率。 結果 報告載體pGFAP-EGFP構建成功，轉染骨髓基質干細胞后部分細胞存活，流式細胞儀測定82.74%的細胞表達EGFP。篩選出的細胞GFAP免疫細胞化學鑒定陽性。體外擴增后可以得到大量的目的細胞。 結論 特異性GFAP 啟動子控制的EGFP的表達可以在體外有效的進行骨髓基質干細胞的篩選和擴增。篩選后的細胞具有膠質細胞表型，可提供足夠的膠質細胞進行神經系統的細胞替代治療。關鍵詞 骨髓基質干細胞; GFAP啟動子; 增強型綠色熒光蛋白（EGFP）; 細胞標記The differentia

3、tion selection of bone marrow stromal cells into neuralglial cells with GFAP promoter Zhang peixun, Jiang baoguo, He xiangjun, et al. Traumatic orthopaedics of People Hospital, Peking University, Beijing, 100044, China.Abstract Objective To study the bone marrow stromal cells differentiation in vitr

4、o and to select the differentiated bone marrow stromal cells with the GFAP promoter-controled EGFP expression. Methods Reconstruct the report vector pGFAP-EGFP, culture bone marrow stromal cells primarily and induce with composite of -ME, RA, forskolin, bFGF, PDGF-AA, HRG- for 7 days. . Transfected

5、bone marrow stromal cells with pGFAP-EGFP and selected with G418 antibiotic. The survived bone marrow stromal cells were observed under fluorescence microscopy and flow cytometry. Results The report vector pGFAP-EGFP was reconstructed successfully. Transfected bone marrow stromal cells surviced and

6、82.74% expressed EGFP. Survived cells were positive to GFAP immunocytochemistry staining. The survived bone marrow stromal cells can be enriched in vitro. Conclusions Bone marrow stromal cells can be selected and enriched in vitro under the GFAP-controled EGFP expression. The selected cells possesse

7、d the phenotypes of neuralglial cells and can provide plenty of cells quantities for cell substitution therapy.Key Words: Bone marrow stromal cells; GFAP promoter; EGFP; cell labeling 骨髓基質干細胞（bone marrow stromal cells,MSCs）是成年動物骨髓中保持分裂和分化潛能的細胞群體19 11。具有多能性分化的骨髓基質干細胞是細胞替代療法的可能來源。MSC在體外預誘導后注射入周圍神經損傷處（

8、Mari Dezawa et al 2001）或直接將MSC注射入神經損傷處（Pedro Cuevas et al 2002）能夠促進神經再生過程，但只有極小一部分MSC分化為了雪旺細胞。因此建立體外篩選、擴增、富集已分化的神經膠質細胞或前體細胞的方法將是一大突破。Michael Brenner發(fā)現了在膠質細胞特異表達的膠質纖維酸性蛋白GFAP的基因序列。1994年又成功克隆了在星形細胞中允許轉基因表達的特異性GFAP啟動子，可以隨著膠質細胞的成熟而特異性開啟并表達下游的目的基因5。本實驗以特異性GFAP 啟動子控制的增強型綠色熒光蛋白的表達來監(jiān)測MSC的分化和擴增，旨在探索一種標記誘導分化的

9、MSC并定向篩選神經膠質細胞,為臨床細胞替代療法提供目的細胞的方法。材料和方法1載體構建pGfa2-cLacZ載體(gift of Micheal Brenner, National Institute of Health, Betheda,MD), 轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5，搖菌擴增后大提質粒（Qiagen plasmid maxi kit）。BglII-SalI酶切pGfa2-cLacZ載體后將回收得到的小片段2.2kb的GFAP啟動子克隆至經VspI-SalI酶切后的pEGFP-N3載體(Clontech, gift of Tang fouchou, Beijing university

10、)中以取代原來的CMV啟動子，得到重構的pGFAP-EGFP-N3載體。割膠回收后轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5，搖菌擴增大提（Qiagen plasmid maxi kit）。重構載體的酶切位點圖及酶切鑒定結果如圖A、B所示。各限制性內切酶均購自華美公司。2 MSCs培養(yǎng)根據Friedenstein12 13和Azizi SA14的方法進行成年SD大鼠MSC的分離。過量的苯巴比妥殺死大鼠（200g）后以-MEM (Gibco)灌注脛骨和股骨骨髓，灌注液在含10%的胎牛血清(Gibco)、200 mg/ml卡那霉素的-MEM中培養(yǎng)。同時加入10ng/ml Leukemia inhibitory fa

11、ctor (LIF, Sigma ,US)以維持MSC的分化能力。48小時后更換培養(yǎng)基，利用MSC的貼壁生長特性反復更換培養(yǎng)基來去除血源性細胞。3 MSC的誘導分化 經傳代篩選培養(yǎng)的MSCs在含-mercaptoethanol (-ME，1mmol/L)的-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。更換培養(yǎng)基后添加all-trans-retinoic acid (RA, 35ng/ml， Sigma)培養(yǎng)3天。移去培養(yǎng)基PBS沖洗后，-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，同時添加forskolin (FSK, 5mmol/L，Sigma)、recombinant human basic-fibroblast growth

12、 factor (bFGF, 10ng/mL，Peprotech, London, UK)、recombinant human platelet derived growth facor-AA (PDGF-AA, 5ng/mL，Peprotech, London, UK)、recombinant human heregulin-(HRG-, 200ng/mL，R&D System, Minneapolis, MN)和10%的胎牛血清。復合物誘導期間細胞不傳代，僅更換一次培養(yǎng)基。4誘導后的MSCs免疫熒光鑒定誘導后的MSCs進行免疫熒光鑒定，應用的一抗為兔抗大鼠S100, P75 (Si

13、gma, US),。二抗為羅丹明標記的山羊抗兔IgG(H+L) (Jackson immunoResearch company,US).5. 誘導后的MSCs轉染應用Lipofectamine2000和Plus試劑（Invitrogen）介導pGFAP-EGFP轉染誘導后的MSCs細胞，轉染后的MSC在含400ug/mlG418(Clontech)的培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)10天。轉染的各項操作均按照試劑說明書進行。6篩選后存活的細胞克隆培養(yǎng)擴增，GFAP免疫熒光鑒定 篩選后存活的細胞經過培養(yǎng)擴增后形成較大的克隆，對細胞克隆進行兔抗大鼠GFAP(Sigma, US)免疫熒光鑒定。7. 篩選擴增后的細胞

14、流式細胞儀測定表達EGFP的細胞比率 篩選擴增以后的細胞培養(yǎng)傳代，0.25%胰蛋白酶消化，離心收集后重懸，流式細胞儀檢測。結果1報告載體pGFAP-EGFP構建成功，限制性內切酶切鑒定符合預計設計（見圖A）。載體的具體酶切位點如圖B所示。 圖1 報告載體pGFAP-EGFP的酶切鑒定圖1 為DNA/Hind III maker, 2為Xho I 和Sal I消化片段，3為XbalI消化片段。4 為EcoR I消化片段。重構載體的酶切鑒定中Xbal I具有三個酶切位點,其中在EGFP下游的位點被甲基化，不參與酶切，因此3中切出的片段只有兩條。圖2 重構質粒載體各個酶切位點Xho I 和Sal I

15、各有一個位點，Xbal I有三個酶切位點，EcoR I沒有酶切位點。2誘導后的MSCs細胞免疫熒光鑒定。S100和P75均呈現陽性。如圖3 圖4 所示圖 3 誘導的MSCs細胞S100免疫熒光染色紅色的為陽性的熒光染色； 藍色的為DAPI復染的細胞核，二者為同一視野（100x）圖 4 誘導的MSCs細胞P75免疫熒光染色紅色的為陽性的熒光染色； 藍色的為DAPI復染的細胞核，二者為同一視野（100x）3. 篩選后存活的細胞克隆GFAP免疫熒光鑒定結果：篩選后表達綠色熒光蛋白的細胞GFAP染色出現紅色的熒光。圖 5 篩選后的MSCs細胞GFAP免疫熒光染色紅色的為陽性的熒光染色； 綠色的為細胞表

16、達的綠色熒光蛋白，二者為同一視野（100x）4. 篩選后存活細胞的流式細胞儀測定熒光細胞的比率圖6 流式細胞儀測定表達EGFP的細胞比率上圖為陰性對照組，下圖為轉染篩選后的細胞，顯示82.74%的細胞表達EGFP。討論pGfa2-cLacZ載體中2163到47為h-GFAP啟動子序列，其中+15位的密碼子ATG突變?yōu)門TG。人，小鼠和大鼠的GFAP基因具有高度同源性18。重構載體的酶切鑒定中Xbal I具有三個酶切位點,其中在EGFP下游的位點甲基化，因此切出的片段只有兩條，4道的三條帶提示重構的質粒載體具有三種分子構象.酶切后得到的片段數量和大小恰好符合，提示載體重構正確。GFAP啟動子正確

17、插入載體替代了原來的CMV啟動子，其下游具有EGFP的基因序列。EGFP已經被廣泛應用于細胞的追蹤檢測3。Marius Wernig等利用Tau基因中插入的EGFP來篩選胚胎干細胞分化來的神經元4。Christian Andressen等利用Nestin在神經前體細胞內表達的特性，采用了Nestin特異性啟動子控制的EGFP表達來篩選胚胎干細胞來源的神經前體細胞8。Yamaguchi M等利用Nestin啟動子控制的GFP表達來監(jiān)測中樞神經系統內的神經形成15。我們以Micheal Brenner的GFAP啟動子為基礎，重構質粒載體pGFAP-EGFP, 轉染MSC后經G418篩選后，利用GF

18、AP啟動子在神經膠質細胞內特異表達來篩選來源于MSCs的神經膠質細胞,為臨床實驗提供足量的細胞來源。應用細胞替代療法的前提是獲得較高純度的細胞，通常有兩種方法4：其一是定向誘導,這需要探索嚴格的分化外環(huán)境和特定的細胞因子作用。即使探索的條件很好也面臨分化的細胞多樣性的問題。其二是細胞系篩選，這需要相對特異的細胞系標志。我們把兩者結合在一起,在體外進行相對定向誘導后,采用特異性GFAP啟動子篩選分化的神經膠質細胞,擴增后可以進行體內的細胞功能替代。神經膠質細胞包括Schwann細胞,星形細胞,少突細胞等。Schwann細胞也表達膠質細胞的特異蛋白GFAP。當誘導后的MSCs表達GFAP，經重構的

19、質粒載體轉染后，GFAP啟動子開啟下游的綠色熒光蛋白得以表達，分化的神經膠質細胞中綠色熒光蛋白的表達與GFAP的表達和細胞形態(tài)的變化密切相關。表達綠色熒光蛋白的膠質細胞可以通過熒光顯微鏡觀察，通過流式細胞儀得到分離純化。此方法可以用來標記MSC來源的神經膠質細胞并監(jiān)測其分化過程和去向，甚至從MSC分化來的多種細胞中分離用于體內移植神經膠質細胞。在本實驗室培養(yǎng)MSC的過程中發(fā)現，大鼠MSC的體外培養(yǎng)需要LIF因子的作用，早期未加LIF的MSC在培養(yǎng)中出現細胞形態(tài)變大，端粒酶檢測發(fā)現MSC細胞衰老，分化能力減弱（未發(fā)表資料），這與Yuehua Jiang等17的發(fā)現一致。神經再生微環(huán)境中增加一定數

20、量的Schwann細胞可以有效促進神經軸突的生長6 16。獲得足量Schwann細胞以及避免免疫排斥反應仍是一大難題。MSCs臨床獲得容易，用MSCs分化成的神經膠質細胞（Schwann細胞）來促進神經軸突再生無疑會給神經再生帶來希望。本研究為MSC的體內移植促進周圍神經再生做了前期的細胞標記工作。致謝Thanks Professor Michael Brenner for his kindly presentation of pGfa2-cLacZ plasmid and technical support, presently Associate Professor of Neurobio

21、logy with a joint appointment in the Department of Physical Medicine & Rehabilitation, Ulabama,USA. Thanks Professor Mari Dezawa, Department of Anatomy, Yokohama City University School of Medicine, Japan, for his kindly theoritical and technical support and encouragement. 參考文獻 1 Devine SM, Cobbs

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