食管癌細(xì)胞中fascin基因核心啟動子區(qū)關(guān)鍵順式作用元件的鑒定

1、食管癌細(xì)胞中fascin基因核心啟動子區(qū)關(guān)鍵順式作用元件的鑒定    摘要：目的：鑒定食管癌細(xì)胞中fascin 基因核心啟動子區(qū)的關(guān)鍵順式作用元件。方法：以人食管癌細(xì)胞為研究對象，綜合運(yùn)用生物信息學(xué)分析、嵌套缺失、定點(diǎn)突變和雙熒光素酶報告基因分析等實驗技術(shù)手段。結(jié)果：在管癌細(xì)胞系KYSE150、EC171 和EC109 中，1）當(dāng)5'端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)從-2900 逐漸截短到-74 時，fascin 基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性在三個食管癌細(xì)胞系中的變化規(guī)律并不一致，在KYSE150 中，總的趨勢是啟動子的轉(zhuǎn)錄活性逐漸降低，至-74時大約降低了50%；而在EC

2、171 和EC109 中，隨著序列被逐漸截短，啟動子的轉(zhuǎn)錄活性不但沒有降低，反而還明顯升高；2）5'端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)從-74 截短到-41 時，fascin 基因啟動子在上述3 種食管癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性幾乎完全喪失；3）與轉(zhuǎn)染含野生型GCbox 位點(diǎn)的pBF-255 和pBF-74 相比，轉(zhuǎn)染含GC box 完全突變（-70/-60 位點(diǎn)）的報告基因質(zhì)粒將導(dǎo)致熒光素酶活性喪失約80%，而轉(zhuǎn)染含GCbox 部分突變的報告基因質(zhì)粒，也可以使報告基因熒光素酶的活性顯著下降。結(jié)論：在食管癌細(xì)胞中，fascin 基因的核心啟動子區(qū)位于-74/-41區(qū)段，而位于-70/-60 的GC box 是調(diào)控f

3、ascin 基因轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵順式作用元件。關(guān)鍵詞：fascin 基因；順式作用元件；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；食管癌細(xì)胞中圖分類號：Q784；R735.1Identification of a key cis-acting element in the corepromoter of fascin in the esophageal carcinoma cellsWu Jianyi1, Lu Xiaofeng2, Du Zepeng2, Li Enmin1, Xu Liyan2(1. Department of Biochemistry and Molecular Biology,Medical Colle

4、ge of Shantou University,GuangDong ShanTou 515041;2. Institute of Oncologic Pathology, Medical College of Shantou University,GuangDong ShanTou 515041)Abstract: OBJECTIVE: To identify a key cis-acting element in the core promoter of fascin in theesophageal cancer cells. METHODS: The potential transcr

5、iption factor binding sites were analyzed andpredicted using transcription factor database. Reporters of fascin promoter were constructed by PCR,nested deletion and site-directed mutagenesis. The activity of fascin promoter was determined by usingdual-luciferase reporter assay system. RESULTS: When

6、deletion of 5'flanking region of fascin from-2900nt to -74nt, the luciferase activity of the promoter was different in the various esophageal cancercells, such as KYSE150, EC171 and EC109 cells. In KYSE150 cells, the activity was decreased withdeletion of the sequences and the pBF-74 construct r

7、etained approximately 50% luciferase activity,while the activity was increased with deletion of sequences to -74nt in EC171 and EC109 cells. Theregion from nt74 to 41 seemed the most critical, since deletion of this sequence led to nearlycomplete loss of the activity in three esophageal cancer cells

8、. Compared with the pBF-255 and pBF-74constructs containing a GC box (from nt70 to 60), the constructs, in which GC box was mutated, theluciferase activity was significantly decreased and only 20% was preserved. CONCLUSION: thesegment between 74 and 41 seems to be critically important to the fascin

9、promoter activity and theGC box (70/60) functioned as an essential element of the promoter in esophageal cancer cells.Keywords:fascin; cis-acting element; transcriptional regulation; esophageal cancer cells 0 引言fascin 基因編碼蛋白產(chǎn)物是一種進(jìn)化上高度保守的球形的肌動蛋白結(jié)合蛋白，在細(xì)胞內(nèi)主要與絲狀肌動蛋白（filament actin，F(xiàn)-actin）結(jié)合，并使F-ac

10、tin 平行聚合形成肌動蛋白束，參與以肌動蛋白為骨架的亞細(xì)胞成分的構(gòu)成。這些亞細(xì)胞成分主要包括使細(xì)胞處于運(yùn)動狀態(tài)的細(xì)胞皮質(zhì)突起和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的微絲束。細(xì)胞皮質(zhì)突起，例如細(xì)胞膜表面的絲狀偽足（filopodia）、微棘（microspikes）、層形足板（lamellipodia）、微絨毛（microvilli）、細(xì)胞樹突和細(xì)胞質(zhì)中的張力纖維等結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞遷移、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間粘附，以及細(xì)胞間的相互作用等生物學(xué)過程1,2。以往有研究發(fā)現(xiàn)，fascin 基因在許多上皮來源的腫瘤細(xì)胞系，如宮頸癌HeLa、胃癌AGS、大腸癌LIM1215 和SW480、胰腺癌BxPC3 和T3H4 等中顯著上調(diào)表達(dá)

11、3-5。而在臨床組織標(biāo)本中，與正常上皮組織相比，fascin 基因在胰腺導(dǎo)管癌、大腸腺癌和雌激素受體陰性的乳腺癌等腫瘤組織中也均上調(diào)表達(dá)3-5。目前的研究結(jié)果提示，fascin 基因?qū)τ谀承盒阅[瘤來講，可能會發(fā)展成為一個潛在的治療靶點(diǎn)6-8，而檢測fascin 基因表達(dá)也可能會作為某些惡性腫瘤判斷預(yù)后或預(yù)警的分子標(biāo)志。有關(guān)食管癌中fascin 基因的表達(dá)特征及其功能意義，近些年來陸續(xù)有研究報道8。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，在永生化食管上皮細(xì)胞SHEE 向食管癌細(xì)胞SHEEmt 的惡性轉(zhuǎn)化中，以及在食管癌組織中，fascin 基因呈現(xiàn)明顯上調(diào)或過表達(dá)9；并且與癌細(xì)胞的侵襲移動密切相關(guān)10,11。然而

12、，迄今為止，關(guān)于fascin 基因在食管癌等惡性腫瘤中轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制依然不甚清楚。本研究擬在以往研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過綜合運(yùn)用嵌套缺失、定點(diǎn)突變，結(jié)合報告基因檢測和生物信息學(xué)分析等方法手段，鑒定出調(diào)控食管癌細(xì)胞fascin 基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵順式作用元件，為進(jìn)一步闡明食管癌細(xì)胞中fascin 基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制提供基本實驗數(shù)據(jù)。1 材料與方法1.1 質(zhì)粒pGL3-Basic(pGLB)和pRL-TK 購自Promega 公司(Madison,WI, USA)。pBF-2900、pBF-1848、pBF-1435、pBF-825、pBF-436 等fascin 基因5'端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)不

13、同長度片段螢火蟲熒光素酶報告基因質(zhì)粒由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室構(gòu)建12。1.2 嵌套缺失實驗以實驗室保存的插有fascin 基因5'端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的質(zhì)粒pBF-1435 為模板進(jìn)行嵌套缺失實驗，pGL3-Basic 上有Kpn I和Mlu I限制性酶切位點(diǎn)，Mlu I限制性內(nèi)切酶可使DNA 形成5'突出末端，可進(jìn)一步被外切核酸酶ExoIII降解；而Kpn I限制性內(nèi)切酶可使DNA 形成3'突出末端，不能被ExoIII降解。將質(zhì)粒pBF-1435 經(jīng)Kpn I/Mlu I雙酶切后，再經(jīng)ExoIII酶切。取不同反應(yīng)時間的酶切后產(chǎn)物，用S1 核酸酶切除單鏈DNA

14、，Klenow 補(bǔ)平末端后，T4DNA連接酶使片段自連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，用pGL3-Basic 載體引物Rvprimer3 和FasnR（序列見表1）進(jìn)行PCR，選取陽性克隆進(jìn)行測序驗證（上?；瞪锛夹g(shù)有限公司）。1.3 fascin 基因5'端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)缺失載體的PCR 法構(gòu)建通過生物信息學(xué)方法預(yù)測-387 到+1 區(qū)段內(nèi)可能存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，為此設(shè)計了5 條5'端引物：F255，F(xiàn)168，F(xiàn)88，F(xiàn)74 及F40（引物序列見表1），以pBF-387 為模板，并以3' 端引物FasnR 為共用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，回收所擴(kuò)增的目的

15、片段，Mlu I/Hind III雙酶切后，連接到pGL3-Basic 載體的Mlu I/Hind III中，以各自引物進(jìn)行PCR 篩選陽性克隆，并進(jìn)行測序鑒定。表1 構(gòu)建fascin 啟動子區(qū)5'缺失子引物序列Tab. 1 Primers for preparing the 5'-deletion constructs of the fascin promoter regionPrimers Sequences Cutting site Position(EU486847)Length(bp)F-255 5'-ACGCGTCGGGGGGGTTAGGTGGCTGG-3&

16、#39; Mlu I -255-226 377F-168 5'-ACGCGTACCGGTGGGGTGAGAGCACCGG-3' Mlu I -168-147 290F-88 5'-ACGCGTGAGCCAGGGGCGGGACAGG-3 Mlu I -88-70 211F-74 5'-ACGCGTACAGGGGGGCGTGGCCTGG-3' Mlu I -74-55 196F-40 5'-ACGCGTCTCGCCTATAAAATGTCCGG-3' Mlu I -40-21 162R-Fasn 5'-AAGCTTGGTGGCAGTAG

17、ACGAGAGGCCGCTG-3 Hind III +122+971.4 fascin 基因5'端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)定點(diǎn)突變載體的構(gòu)建針對-74/-41 區(qū)段序列設(shè)計5'端定點(diǎn)突變引物，引物序列見表2，分別就-74/-69、-70/-60、-68/-63 及-66/-57 區(qū)段相應(yīng)位置的核苷酸進(jìn)行置換突變。以野生型pBF-74（-74/ +122）為模板，分別以上述5'定點(diǎn)突變引物及3'端共用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，回收所擴(kuò)增的目的片段，連接至中間載體pMD18-Tvector（TaKaRa 公司）中，經(jīng)測序鑒定目的序列確已發(fā)生突變后，對此中間重組子進(jìn)行Mlu I/ Hi

18、nd III限制性雙酶切，回收含突變序列的目的片段，并亞克隆至pGL3-basic 載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上。表2 以pBF-74 為模板構(gòu)建突變子引物序列Tab. 2 Primers for preparing site-directed mutations using pBF-74 construct as amplified templatePrimers Sequences Cutting site Position5'-ACAGGGGGGCGTGGCCTGGTGGCGCTGACGTCAC-3' -74-41F-74/-69s 5'-ACGCGTGTCGACGGGC

19、GTGGCCTGGTGGCGCTGACGTCAC-3' Mlu I -74-41F-70/-60s 5'-ACGCGTACAGTATCTATGTTACTGGTGGCGCTGACGTCAC-3' Mlu I -74-41F-68/-63s 5'-ACGCGTACAGGGGTCGACGGCCTGGTGGCGCTGACGTCAC-3'Mlu I -74-41F-66/-57s 5'-ACGCGTACAGGGGGTATGTTAAGTGTGGCGCTGACGTCAC-3' Mlu I -74-41F-62/-57s 5'-ACGCGTACA

20、GGGGGGCGTGAATTCGTGGCGCTGACGTCAC-3' Mlu I -74-41R-Fasn 5'-AAGCTTGGTGGCAGTAGACGAGAGGCCGCTG-3 Hind III +122+971.5 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)食管癌細(xì)胞系KYSE150、EC171 和EC109，在含10%小牛血清的199 培養(yǎng)基或DMEM（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)培養(yǎng)基中貼壁生長，5% CO2，37，濕度95%用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA 的消化液消化，進(jìn)行細(xì)胞傳代。對于需轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，將細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板或6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)

21、胞匯合率為50%80%時，可用于質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染實驗。1.6 瞬時轉(zhuǎn)染與雙熒光素酶活性檢測接種于96 孔培養(yǎng)板中的食管癌細(xì)胞用于雙熒光素酶活性檢測。提取質(zhì)粒并測定其含量。用緩沖液EB(QIAGEN 公司質(zhì)粒提取試劑盒中提供)將pGLB 以及含fascin 基因5'端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列的重組pGLB 質(zhì)粒稀釋至100ng/l，內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK 稀釋至20ng/l，然后將 pGLB 和重組pGLB 質(zhì)粒分別與pRL-TK 按501 混合，即1g0.02g。質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染步驟參照Superfect 轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN, Mainz, Germany)說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48h

22、，收獲細(xì)胞。每組實驗樣品3 個平行實驗孔，并至少進(jìn)行3 次獨(dú)立重復(fù)實驗。雙熒光素酶活性檢測參照雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)（Promega 公司）操作手冊，在TD20/20 型照度計上進(jìn)行。根據(jù)TD20/20 型照度計配置的軟件包計算出各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的相對熒光素酶活性(螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶)，以此代表重組pGLB 質(zhì)粒報告基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。1.7 統(tǒng)計學(xué)分析各組啟動子轉(zhuǎn)錄活性實驗數(shù)據(jù)均計算平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差( ±s)，應(yīng)用SPSS13.0 軟件(SPSS, Chicago, IL,USA)對各組實驗數(shù)據(jù)之間是否有顯著性差別進(jìn)行方差分析，P< 0.05 表示有統(tǒng)計學(xué)意義。2

23、 結(jié)果2.1 fascin 基因5端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)不同長度的報告基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以pBF-1435 為模板，通過嵌套缺失實驗，構(gòu)建fascin 基因5端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)不同長度的螢火蟲熒光素酶報告基因表達(dá)質(zhì)粒。采用PCR 方法，結(jié)合1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，實驗結(jié)果見圖1。從圖1 可見，與pBF-1435 質(zhì)粒所插入的外源片段相比，來源于各嵌套缺失子質(zhì)粒中的外源片段的大小依次被截短，表明成功構(gòu)建了以pBF-1435 為模板，所插入的外源片段依次被截短的系列嵌套缺失質(zhì)粒。而進(jìn)一步的測序結(jié)果顯示，已獲得一系列fascin 基因5'端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)逐漸被縮短的螢火蟲熒光素酶報告基因表達(dá)質(zhì)粒pBF-11

24、48（-1148/+122）、pBF-808（-808/+122）、pBF-610（-610/+122）、pBF-508（-508/+122）、pBF-387（-387/+122）、pBF-316（-316/+122）、pBF+19（+19/+122）和pBF+82（+82/+122）。2.2 fascin 基因5端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)缺失不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的報告基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以質(zhì)粒pBF-387 為模板，用PCR 法擴(kuò)增fascin 基因5端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)缺失不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的片段，插入pGL3-Basic 載體中，進(jìn)一步獲得fascin 基因5端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)缺失不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的螢火蟲熒光素酶報告基因表

25、達(dá)質(zhì)粒。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，實驗結(jié)果見圖2。從圖2 可見，所獲得PCR 產(chǎn)物的大小與設(shè)計的長度一致。而進(jìn)一步的測序分析也驗證了序列的正確性。這表明已成功獲得fascin 基因5端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)缺失不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的報告基因表達(dá)質(zhì)粒，包括pBF-255（-255/+122）、pBF-168（-168/+122）、pBF-88（-88/+122）、pBF-74（-74/+122）和pBF-40（-40/+122）。M -1435 -1148 -808 -610 -508 -387 -316 +19 +821000bp 圖1 fascin 基因5端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)不同長度報告基因表達(dá)

26、質(zhì)粒的PCR 鑒定結(jié)果Fig. 1 Identification of PCR product from different length reporters of 5'regulation region of fascinM：200bp DNA Marker 500bp M -255 -168 -88 -74 -40圖2 fascin 基因5端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)缺失不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的報告基因表達(dá)質(zhì)粒的PCR 鑒定結(jié)果Fig. 2 Identification of PCR product from the reporters with deleted cis-acting elem

27、ents of 5'regulation region offascinM, 100bp DNA Marker2.3 fascin 基因5端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)定點(diǎn)突變子的鑒定以野生型pBF-74 為模板，以5端引物為定點(diǎn)突變引物，以3端引物為共用引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，各PCR 產(chǎn)物，包括-74/-69s、-70/-60s、-68/-63s、-66/-57s 和-62/-57s 等，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步鑒定，鑒定實驗結(jié)果見圖3a。然后，將各PCR 產(chǎn)物分別克隆至中間載體pMD18-T vector 中，構(gòu)建中間重組子，進(jìn)行測序鑒定，詳見圖4。從圖4 可見，與野生型（-74/-41w）相比，

28、所設(shè)計的相應(yīng)位置的核苷酸的確發(fā)生了置換突變。在此基礎(chǔ)上，對這些中間重組子進(jìn)行Mlu I/ Hind III雙酶切，回收目的片段，定向亞克隆到pGL3-Basic 載體的Mlu I/Hind III位點(diǎn)，雙酶切鑒定亞克隆重組子的瓊脂糖凝膠電泳實驗結(jié)果見圖3b。從圖3b 可見，所構(gòu)建的重組表達(dá)載體pBF-74/-69s、pBF-70/-60s、pBF-68/-63s、pBF-66/-57s和pBF-62/-57s 切出的目的片段大小與原PCR 片段大小一致(圖3a)，表明已經(jīng)成功獲得核苷酸定位置換突變的重組報告基因質(zhì)粒。(b)pBF-74/-69spBF-70/-60spBF-68/-63spBF

29、-66/-57spBF-62/-57sM(a)-74/-69s-70/-60s-68/-63s-66/-57s-62/-57sM500bp 500bp 圖3 fascin 基因5端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)突變子的鑒定(a) fascin 基因5端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)定點(diǎn)突變PCR 產(chǎn)物的鑒定 (b) 重組fascin 基因5端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)定點(diǎn)突變子質(zhì)粒Mlu I 和 Hind III 雙酶切鑒定Fig. 3 Identification of mutant constructs of. 5'regulation region of fascin(a) Identification of PCR product

30、with site-directed mutagenesis of. 5'regulation region of fascin(b) Identification of recombinant site-directed mutants of 5regulation region of fascin by digested with Mlu IandHind III.M, 100bp DNA Marker -74/-69s-70/-60s-68/-63s-66/-57s-66/-57s-74/-41w圖4 fascin 基因5端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)定點(diǎn)突變質(zhì)粒測序結(jié)果Fig. 4 T

31、he sequencing of site-directed mutants of 5regulation region of fascin-74/-41w 為野生型pBF-74 質(zhì)粒；-74/-69s, -70/-60s, -68/-63s , -66/-57s 和-62/-57s 為GC box 位點(diǎn)突變質(zhì)粒-74/-41w means pBF-74; -74/-69s, -70/-60s, -68/-63s , -66/-57s and -62/-57s means mutated GC box site.2.4 fascin 基因核心啟動子區(qū)的鑒定將攜有fascin 基因5端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)

32、不同長度的DNA 序列片段的報告基因載體，包括pBF-2900、pBF-1848、pBF-1435、pBF-1148，pBF-825、pBF-808，pBF-610，pBF-508，pBF-436、pBF-387，pBF-316，pBF-255、pBF-168、pBF-88、pBF-74、pBF-40、pBF+19和pBF+82，分別與內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK 共轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞系KYSE150、EC171 和EC109，檢測相對熒光素酶活性，檢測結(jié)果見圖5。從圖5 可見，1）在本文的實驗條件下，-74/+122是fascin 基因表現(xiàn)其啟動子轉(zhuǎn)錄活性的最短片段；2）從-2900 逐漸截短到-74

33、 時，fascin 基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性在三個食管癌細(xì)胞系中的變化規(guī)律并不一致，在KYSE150 中，總的趨勢是啟動子的轉(zhuǎn)錄活性逐漸降低，至-74 時大約降低了50%；而在EC171 和EC109 中，隨著序列被逐漸截短，啟動子的轉(zhuǎn)錄活性不但沒有降低，反而還明顯升高；3）從-74 截短到-41時，fascin 基因啟動子在上述3 種食管癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性幾乎完全喪失。上述實驗結(jié)果說明，在管癌細(xì)胞系KYSE150、EC171 和EC109 中，fascin 基因的-74/-41 區(qū)段是該基因啟動子的核心區(qū)序列。 -2900 +1 Luc-1848 +1 Luc-1435 +1 Luc-

34、1148 +1 Luc-825 +1 Luc-808 +1 Luc-610 +1 Luc-508 +1 Luc-436 +1 Luc-387 +1 Luc+1 Luc-255 +1 Luc-85 +1 Luc-74 + 1 Luc-40 + 1 Luc+19 L uc+82 L u cLuc-168 +1 Luc0 100 200 300 400 500vector+82+19-40-74-85-168-255-316-387-436-508-610-808-825-1148-1435-1848-2900 KYSE150EC109EC171相對熒光素酶活性(%)*-316 *圖5 fascin

35、基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件定位分析Fig. 5 Localization analysis of the transcriptional regulatory element in fascin promoter by using dual-luciferasereporter assay system以pBF-2900質(zhì)粒報告基因熒光素酶的活性作為100%，以pGL3-Basic vector 作為空白對照。每個質(zhì)粒均進(jìn)行3次獨(dú)立的實驗，而每次實驗均設(shè)3個平行樣，計算平均值與標(biāo)準(zhǔn)差。星號 (*)代表與pBF-74組數(shù)據(jù)比較，報告基因熒光素酶活性的差異有統(tǒng)計學(xué)意義， P < 0.01.Th

36、e pBF-2900 construct was set as 100% .pGL3-Basic vector (vector) was served as a blank control. The data arerepresentative of at least 3 independent experiments. Transfections were carried out in triplicate for eachexperiment. The asterisks (*) indicate P < 0.01, compared with the group transfect

37、ed with the pBF-74 construct.2.5 fascin 基因啟動子核心區(qū)關(guān)鍵順式作用元件的鑒定利用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測程序 基因啟動子的-74/-1 區(qū)段，包括核心區(qū)段(-74/-41)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這一區(qū)域存在兩個潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中-70/-60(GGGGGCGTGGC)為GC box，-50/-41(CTGACGTCAC)為轉(zhuǎn)錄因子CRE/AP-1 的經(jīng)典結(jié)合位點(diǎn)，-34/-28(TATAAAA)為一個經(jīng)典的TATA box，詳見圖6。在以往的研究中我們曾發(fā)現(xiàn)，在食管癌細(xì)胞EC109 中，當(dāng)缺失CRE/AP-1 位點(diǎn)或同時缺失CRE/AP-

38、1 位點(diǎn)和TATA box 時，fascin 基因的轉(zhuǎn)錄活性，相對于野生型-387/+122，下降得并不明顯；而當(dāng)缺失GC box 時，fascin 基因的轉(zhuǎn)錄活性明顯下降13，這提示GC box(-70/-60)可能是啟動子核心區(qū)段的關(guān)鍵順式作用元件。為了進(jìn)一步證明這一點(diǎn)，將含有GC box 元件的野生型質(zhì)粒pBF-255 和pBF-74，以及該GC box 元件位點(diǎn)完全突變質(zhì)粒pBF-70/-60s、部分位點(diǎn)突變質(zhì)粒pBF-74/-69s、pBF-68/-63s、pBF-66/-57s和pBF-62/-57s 分別與內(nèi)參照質(zhì)粒PRL-TK共轉(zhuǎn)染至食管癌細(xì)胞KYSE150、EC171 和EC

39、109，檢測相對熒光素酶活性，檢測結(jié)果見圖7。從圖7 可見，在上述3 種食管癌細(xì)胞中，與轉(zhuǎn)染含野生型GC box 位點(diǎn)的pBF-255 和pBF-74 相比，轉(zhuǎn)染含GC box 完全突變（-70/-60 位點(diǎn)）的報告基因質(zhì)粒將導(dǎo)致熒光素酶活性喪失約80%，而轉(zhuǎn)染含GC box 部分突變的報告基因質(zhì) 粒，也可以使報告基因熒光素酶的活性顯著下降。這表明fascin 基因啟動子區(qū)-70/-60 區(qū)段的GC box 元件，可能是食管癌細(xì)胞中調(diào)控fascin 基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵順式作用元件。-74ACAGGGGGGCGTGGCCTGGTGGCGCTGACGTCACCTCGCCTATAAAATGTC

40、CGGGGCGCCGCTAGCTGGGCTTT-1GC box CRE/AP1TATA box圖6 fascin 基因啟動子-74/-1 區(qū)段轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果Fig. 6 Prediction of transcription factor binding sites in the segment from 74 to +1 of fascin promoterGC box(70/60)、CREB/AP-1 結(jié)合位點(diǎn)(50/41)和TATA box (34/28)用下劃線表示The GC box (70/60), CREB/AP-1 binding site (50/41) and T

41、ATA box (34/28) were showed by underline.3 討論基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要涉及順式作用元件和反式作用因子兩個方面。有關(guān)fascin 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子機(jī)制方面的研究，近年曾有人報道。2003年，Bros 等人在研究樹突狀細(xì)胞成熟分子機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，fascin 基因的啟動子位于該基因5'端3kb 區(qū)域內(nèi)。該基因的上調(diào)表達(dá)由這一區(qū)段中的某種或某些順式作用元件控制。而在距起始密碼子約200bp 內(nèi)鑒定出一個核心啟動子區(qū)域，含有一個典型的GCbox，一個cAMP 反應(yīng)元件/AP-1 結(jié)合位點(diǎn)的復(fù)合序列和一個TATA box14。2005 年，F(xiàn)rancesca M 等人研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)元前體細(xì)胞NT2 中，通過RNA 干擾實驗技術(shù)，沉默CREB 元件結(jié)合蛋白CBP，可使fascin 基因的表達(dá)明顯下降，表明CREB 結(jié)合蛋白CBP 可能參與了神經(jīng)元中fascin 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控15。2007 年，Vignjevic D 等人研究報道，在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中，-catenin-TCF信號通路參與了fascin 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控16。2009 年，Hashimoto 等人研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、結(jié)腸癌和