幾種植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法

1、 生物技術(shù)2008年18(5 84土壤的各種酶活性。由表3表9可以看出, 處理的土壤中, 所檢測(cè)的土壤酶活性均發(fā)生了一定變化?？傮w來(lái)講, 施用沼肥的土壤酶活性明顯高于對(duì)照, 酶活性變化主要體現(xiàn)在生長(zhǎng)中期, 即生長(zhǎng)60d 時(shí)均達(dá)到最大值, 之后則下降。不同酶活性變化差別較大。脲酶是土壤中最活躍的水解酶類(lèi)之一, 能水解施入土壤中的尿素, 釋放出供作物利用的銨離子, 脲酶的活性與土壤中有機(jī)物質(zhì)含量、氮的供給與利用情況、土壤微生物量和其它養(yǎng)分含量相關(guān)。由表可知, 在施入沼渣情況下, 土壤的脲酶活性明顯增加, 脲酶活性大小表現(xiàn)為B2>B1>A2>A1, 且當(dāng)茄子生長(zhǎng)至50d 時(shí),B2處

2、理的土壤脲酶活性達(dá)到最高, 比A2提高92%。其原因可能是, 施用沼渣增加了土壤中活性有機(jī)質(zhì)含量, 為微生物的生長(zhǎng)提供了較多更易利用的碳源、氮源, 促進(jìn)了微生物生長(zhǎng), 增加了某些土壤微生物的群體數(shù)量。微生物數(shù)量的增加及其生長(zhǎng)速率的增大可有效地促進(jìn)脲酶的活性。3. 2土壤活性有機(jī)質(zhì)和土壤酶活性是表征土壤質(zhì)量和土壤肥力的兩個(gè)重要指標(biāo)。本文探討了施用沼渣對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)和酶活性的影響, 并分析了二者之間的相關(guān)性。試驗(yàn)結(jié)果表明, 增加土壤中脲酶、轉(zhuǎn)化酶、, 有機(jī)質(zhì)與脲酶、。, 那么即使是有較高的含量, 也起不到好效果。因此在評(píng)價(jià)有機(jī)肥時(shí), 不僅要看其中營(yíng)養(yǎng)成分含量, 也需要注重其成分在土壤中的轉(zhuǎn)化利用情況

3、和對(duì)土壤理化性質(zhì)、土壤微環(huán)境的影響。3. 3土壤養(yǎng)分有機(jī)質(zhì)變化規(guī)律一致。不同處理之間, 實(shí)驗(yàn)前后土壤養(yǎng)分含量變化是, 沼肥組高于不施沼肥組, 且有極顯著差異, 自然土組高于滅菌土組。沼肥可明顯提高蔬菜土壤的養(yǎng)分含量影響。各種土壤酶活性隨著時(shí)間的推進(jìn), 先增高, 到生長(zhǎng)期3040d 達(dá)最大值, 后又減低, 后期回升。同時(shí)施沼肥處理各種酶活性高于相對(duì)應(yīng)的不施沼肥組, 且有顯著(多酚氧化酶、蔗糖酶 或極顯著差異, 自然土組高于滅菌土組, 并且都有顯著差異。表明沼肥與微生物顯著影響土壤酶的活性, 施用沼肥可增加士壤酶活性, 促使土壤生化過(guò)程增強(qiáng), 有機(jī)物轉(zhuǎn)化、循環(huán)加快, 土壤肥力提高。參考文獻(xiàn):1徐明

4、崗, 于榮, 王伯仁. 長(zhǎng)期不同施肥下紅壤活性有機(jī)質(zhì)與碳庫(kù)管理指數(shù)變化J.土壤學(xué)報(bào),2006,43(5 :723-729.2徐明崗, , 王伯仁. J.土壤肥料,2000(6 :3-3, 等. :19-21., , . 不同有機(jī)肥料對(duì)土墩生物活性有機(jī)質(zhì)組J.植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào),2001,7(4 :374-378.5張?jiān)伱? 周?chē)?guó)逸, 吳寧. 土壤酶學(xué)的研究進(jìn)展J.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào),2004,12(1 :83-89.6高瑞, 呂家瓏. 長(zhǎng)期定位施肥土壤酶活性及其肥力變化研究J.中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005,13(1 :143-146.專(zhuān)題綜述RE VIEW ARTIC LES幾種植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載

5、體的構(gòu)建方法(1. 吉林省農(nóng)科院生物技術(shù)研究中心, 吉林長(zhǎng)春130124; 2. 東北師范大學(xué)遺傳與細(xì)胞研究所, 吉林長(zhǎng)春130024摘要:表達(dá)載體的構(gòu)建在植物基因工程研究中占據(jù)重要地位, 直接關(guān)系到目的基因的表達(dá)效果。作者在收集整理前人的工作基礎(chǔ)上, 比較分析了5種不同載體構(gòu)建方法的特點(diǎn), 給出了不同載體構(gòu)建方法的適用性建議, 期望能對(duì)植物基因工程中的載體構(gòu)建工作提供有益幫助。在構(gòu)建多片段連接的小載體的時(shí)候推薦用一步克隆法, 在構(gòu)建多片段連接的復(fù)雜的大載體時(shí)采用相應(yīng)的復(fù)雜載體構(gòu)建技術(shù), 在已獲得無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株時(shí)采用三段T -DNA 構(gòu)建方法構(gòu)建載體。在做基因功能驗(yàn)證時(shí)采用的G ate

6、way 技術(shù), 非常簡(jiǎn)單的載體構(gòu)建可以采用傳統(tǒng)的酶切連接的構(gòu)建方式?，F(xiàn)在的主流構(gòu)建載體方式是利用結(jié)合其他手段的G ateway 技術(shù), 未來(lái)載體的發(fā)展趨勢(shì)將是無(wú)酶連接。關(guān)鍵詞:載體; 構(gòu)建; G ateway 技術(shù); 三段T -DNA ; 一步克隆法中圖分類(lèi)號(hào):Q943.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1004-311X (2008 05-0084-04林春晶, 韋正乙, 蔡勤安, 侯敬堯1111,2, 邢少辰13Approaches of Constructing Expressional V ectors U tilized inPlant G enetic TransformationLI N

7、 Chun -jing ,WEI Zheng -yi , C AI Qin -an , H OU Jing -yao1111,2(1. Biotechnology Research Center , Jilin Academy of Agricultural Sciences , Changchun 130033, China ; 2. Institute of G enentics and Cytology , N ortheast N ormal University , Changchun 130024, China , XI NG Shao -chen13Abstract :Const

8、ruction of expression vector plays an im portant role in plant gene engineering , and is closely related with the expressional results of target gene. Based on the previous research w ork , the five different kinds of vector construction methods were summarized depending on their con 2struction stra

9、tegy. The suggestions have been proposed , aiming at specific plant expressional vector , to utilize the different construction strategy. C onstruction of multi -link in a serials of small fragment of vector cloning method recommended by one step methods , when building a com plex multi -link fragme

10、nts of the large vector using the com plex constructing vector technology , in order to get the marker -free transgenic plants it can be used three T -DNAs vector construction methods. Adoption of the G ateway technology in doing functional verification , constructing very sim ple vector can be usin

11、g the traditional method of construction though digestion and connection. The mainstream way of construction vectors now is to use G ateway technology combing with other means , the development trend of the future constructing vector will be on no enzyme connection. At the same time , the tendency o

12、f plant vector construction in the future was prospected. I t is hoped to prom ote the understandings of plant expres 2sional vector construction.K ey w ords :construction; vector ; gateway ; three T -DNAs ; one -step cloning在植物基因工程研究中, 載體是攜帶靶DNA 片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的媒介, 沒(méi)有載體, 目的基因無(wú)法進(jìn)入受收稿日期:2007-10-18; 修

13、回日期:2008-05-12(基金項(xiàng)目:吉林省科技廳農(nóng)業(yè)重大項(xiàng)目“營(yíng)養(yǎng)、高效、耐鹽、抗病水稻體, 即使進(jìn)入受體細(xì)胞也無(wú)法表達(dá)2。細(xì)菌質(zhì)粒載體或噬菌體新品種選育”,20065008 資助載體連接啟動(dòng)基因及多聚核糖體的基因序列就組成了表達(dá)型作者簡(jiǎn)介:林春晶(1976- , 女, 吉林省梨樹(shù)人, 碩士, 助理研究員, 研載體。表達(dá)載體的構(gòu)建是一項(xiàng)非常重要但又比較繁瑣的工作, 究方向:植物轉(zhuǎn)基因,Email :linchunjing1tom. com ; 3通訊作者:邢少辰(1964- , 男, 博士, 研究員, 從事植物逆境分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因研究, 因此, 對(duì)研究表達(dá)載體的構(gòu)建方法具有重要現(xiàn)實(shí)意義1

14、。Email :xingsc64yaboo. com. cn 。 2008年18(5 生物技術(shù)85隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展, 適合于不同研究目的各種載體系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生, 其中在轉(zhuǎn)基因植物中最常用的是質(zhì)粒載體。在為某種特定的植物構(gòu)建表達(dá)載體時(shí), 為了使外源基因高效、安全表達(dá), 或由于特定的要求, 需要構(gòu)建新載體或改造已有載體, 而選擇一種合適的載體構(gòu)建方法, 從而達(dá)到方便、快捷的目的就顯得十分重要。鑒于目前還沒(méi)有關(guān)于對(duì)載體構(gòu)建技術(shù)方面的總結(jié), 在收集整理前人工作的基礎(chǔ)上, 本文選擇介紹了其中幾種具有代表性的策略, 對(duì)其適用的情況作了闡述, 進(jìn)而指出它們的應(yīng)用潛力和主要應(yīng)用領(lǐng)域, 期望對(duì)實(shí)際操作起

15、到借鑒作用。1載體構(gòu)建方法1. 1傳統(tǒng)的載體構(gòu)建方法質(zhì)粒載體DNA 在體外經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切, 然后在DNA 連接酶的作用下同目的基因結(jié)合成環(huán), 最終得到轉(zhuǎn)化載體。在此過(guò)程中, 一般的步驟是, 先在具有多克隆位點(diǎn)的初步載體上尋找合適的酶切位點(diǎn), 得到入門(mén)載體。為了與合適的啟動(dòng)子、選擇性標(biāo)記基因等序列元件連接, 中間還需要轉(zhuǎn)換多個(gè)載體和一系列的酶切、連接、轉(zhuǎn)化、回收等工作, 因此, 體構(gòu)建方法在構(gòu)建多片段拼接的復(fù)雜載體時(shí), 實(shí)際操作往往比較麻煩, , 力。但是, 單時(shí), 、穩(wěn)妥的選擇, 。1. 2G ateway 技術(shù)G ateway 是Invitrogen 公司開(kāi)發(fā)的一項(xiàng)基因克隆和表達(dá)的新技術(shù)

16、, 它利用位點(diǎn)特異重組構(gòu)建入門(mén)載體(entry clone 后, 不再需要使用限制性內(nèi)切酶和連接酶, 而且一旦擁有了一個(gè)入門(mén)載體, 就可以利用它將目標(biāo)基因多次轉(zhuǎn)移到各種不同的表達(dá)載體(目的載體,destination vector 上。此外, 由于在重組時(shí)DNA 片段的閱讀框和方向保持不變, 因而不會(huì)影響不同基因的測(cè)序結(jié)果, 因而每當(dāng)使用一種新的表達(dá)系統(tǒng)時(shí), 可以節(jié)省大量時(shí)間。G ateway 技術(shù)是一種通用性的克隆方法, 利用該技術(shù)可以快速、高效地將目的基因同時(shí)構(gòu)建到多種與G ateway 技術(shù)兼容的載體系統(tǒng)中, 用于基因的蛋白質(zhì)表達(dá)和功能分析3。G ateway 技術(shù)以噬菌體的位點(diǎn)特異性重

17、組體系為基礎(chǔ), 只需BP 和LR 兩個(gè)反應(yīng)就可以完成載體的構(gòu)建。BP 反應(yīng)旨在將目的基因從目的載體或PCR 產(chǎn)物重組進(jìn)入供體載體(do 2nor vector 。創(chuàng)建入門(mén)克隆, 通過(guò)PCR 或傳統(tǒng)的克隆方法將目的基因插入門(mén)載體, 然后混合含有目的基因的入門(mén)克隆與合適的目的載體, 以及G ateway LR Clonase 酶, 得到所需的表達(dá)克隆載體, 在合適的宿主中, 達(dá)和分析。, 片段后, 在PCR 產(chǎn)物的5,3, at 2-BP 反應(yīng)酶催化, attL1和attL2, 同時(shí)生成含有目的基因的入門(mén)克隆, 而LR 反應(yīng)用于將目的基因從入門(mén)克隆重組進(jìn)入目的載體, 反應(yīng)由LR 反應(yīng)酶混合物催化。

18、入門(mén)克隆基因兩端具有attL1和attL2位點(diǎn), 目的載體上含有attR1和at 2tR2位點(diǎn), 在LR 反應(yīng)酶作用下發(fā)生定向重組, 形成新的位點(diǎn)attB1和attB2, 從而將目的基因轉(zhuǎn)移到目的表達(dá)載體中, 具體工作原理見(jiàn)圖14,5 。圖1G ateway 技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體4,5Figure 1C onstruction of expression vector using gateway technology由此可見(jiàn),G ateway 的優(yōu)勢(shì)有以下幾個(gè)方面:(1 簡(jiǎn)單快速的反應(yīng):在室溫60min 后即可轉(zhuǎn)化E. coli ; (2 克隆效率高:>90%甚至>99%的克隆是目標(biāo)克

19、隆; (3 快速直接克隆PCR 產(chǎn)品; (4 特異性反應(yīng):保持閱讀框架和基因的位置不變。目前, G ateway 技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在許多領(lǐng)域中, 如構(gòu)建RNAi 載體時(shí)優(yōu)先考慮使用此技術(shù)。楊美英等6構(gòu)建了番茄茄紅素-環(huán)化酶基因高效沉默載體; 徐化學(xué)等構(gòu)建了水稻OsDAD1基因的4RNA 干涉載體, 也有的研究者將G ateway 技術(shù)和T A 載體構(gòu)建相結(jié)合, 得到實(shí)用、廉價(jià)與兼容的T A 載體7。1. 3含三段T -DNA 載體抗生素篩選標(biāo)記基因是目前轉(zhuǎn)基因植物安全性的隱患之一, 很多植物轉(zhuǎn)基因材料因此而不能獲準(zhǔn)商品化生產(chǎn)?，F(xiàn)在有幾種無(wú)篩選標(biāo)記的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù), 包括共轉(zhuǎn)化法(co -8tran

20、s formation 、定位重組體系(site -specific recombination 9、多元自動(dòng)轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)(mult -auto -trans formation vector 10、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)(transposition system 11和同源重組體系(hom olo 212g ous recombination 等, 但只有共轉(zhuǎn)化法的應(yīng)用最為成功。共轉(zhuǎn)化法就是利用基因槍介導(dǎo)將分別攜帶目的基因和標(biāo)記基因的二個(gè)質(zhì)粒載體混合轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中, 之后即可在T 1或T 2的分離后代中獲得無(wú)篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株, 不足的是轉(zhuǎn)化頻率比較低13。利用分別含有不同雙元表達(dá)載體的農(nóng)桿菌混合侵染

21、植物細(xì)胞8, 同時(shí)含有二個(gè)不同雙元表達(dá)載體的農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞11或含有二段T -DNA 雙元表達(dá)載體的農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞14,15。由于目標(biāo)基因和選擇標(biāo)記基因位于不同載體或不同T -DNA 上, 后代中能夠獲得無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株, 獲得頻率同樣比較低。如圖2所示, 葉興國(guó)等研究構(gòu)建了包含三段T -DNA 的雙元表達(dá)載體, 其中的一段T -DNA 區(qū)域含標(biāo)記基因, 另外二段T -DNA 區(qū)域含目標(biāo)基因, 用其轉(zhuǎn)化大豆后較高頻率獲得了無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株16。1. 4一種通用高效的復(fù)雜載體構(gòu)建新方法傳統(tǒng)的載體構(gòu)建方法在構(gòu)建多片段拼接的復(fù)雜載體時(shí), 往往操作步驟繁瑣, 通常要構(gòu)建多個(gè)中間載體, 這里以陸

22、云華等17構(gòu)建質(zhì)體定點(diǎn)表達(dá)載體pRS MG A 為例, 介紹一種通用高效的復(fù)雜載體構(gòu)建新方法, 它屬于多片段拼接的水稻單交換表達(dá)載體, 是一種簡(jiǎn)便、通用、高效的復(fù)雜載體構(gòu)建方法。此法在引物設(shè)計(jì)時(shí), 在目的片段5端加上隨機(jī)設(shè)計(jì)的接頭, 利用 生物技術(shù)2008年18(5 86PCR 克隆目的片段, 再用T 4DNA 聚合酶3-5外切酶活性處(pBluescript SK (+ -man -g fp -aadA 的構(gòu)建為例(圖4 ,介紹了一種通用、高效的載體構(gòu)建的方法, 簡(jiǎn)稱一步克隆法。它適合構(gòu)建大小為6kb 以下的載體。此新方法是在PCR 引物設(shè)計(jì)時(shí), 相連片段設(shè)計(jì)15bp 的同源序列,PCR 克

23、隆目的片段后, 產(chǎn)生多個(gè)首尾具同源末端的片段, 然后進(jìn)行多片段定向連接、轉(zhuǎn)化和重組子鑒定。四個(gè)片段拼接的質(zhì)體載體pS MG A , 應(yīng)用此法構(gòu)建僅需做一次連接、轉(zhuǎn)化即可。該方法設(shè)計(jì)操作相對(duì)簡(jiǎn)便, 無(wú)需中間載體的構(gòu)建, 減少連接和轉(zhuǎn)化次數(shù) 。作者利用該法構(gòu)建了多個(gè)載體, 證明這是一種簡(jiǎn)便、通用、高效并值得推廣的構(gòu)建小載體的方法。理PCR 克隆目的片段, 產(chǎn)生多個(gè)首尾相匹配的粘性末端, 進(jìn)行多片段定向連接、轉(zhuǎn)化、重組子鑒定。七個(gè)片段拼接的表達(dá)載體pRS MG A 的構(gòu)建, 只需做兩次連接轉(zhuǎn)化就可以完成, 且其重組轉(zhuǎn)化效率高。陸云華等已經(jīng)用這種方法構(gòu)建了幾十個(gè)載體, 證明這是一種簡(jiǎn)便、通用、高效的復(fù)

24、雜構(gòu)建載體的方法。具體見(jiàn)圖3 。圖2三段T -DNA Figure 2C onstructed of three T -DNAs圖4質(zhì)粒pS MG A 的構(gòu)建18Figure 4C onstruction of the vector pS MG A2結(jié)語(yǔ)本文簡(jiǎn)要介紹了目前已經(jīng)成熟的幾種載體構(gòu)建技術(shù)的原理、特點(diǎn)和應(yīng)用, 并對(duì)幾種載體構(gòu)建方法做了一個(gè)綜合評(píng)價(jià), 表1中比較了5種不同載體構(gòu)建方法的特點(diǎn)。指出了這些方法的應(yīng)用領(lǐng)域和潛力, 其中尤其以G ateway 技術(shù)和一步克隆法最具代表性, 是目前載體構(gòu)建的主流手段, 而今后的發(fā)展趨勢(shì)是多種方法與G ateway 技術(shù)結(jié)合起來(lái)的共同應(yīng)用19,20。

25、隨著植物基因工程技術(shù)的不斷更新, 轉(zhuǎn)基因植物載體構(gòu)建將朝著設(shè)計(jì)操作簡(jiǎn)便、安全、通用、高效、經(jīng)濟(jì)的方向發(fā)展。已經(jīng)有報(bào)道證明, 目前能夠?qū)崿F(xiàn)兩個(gè)片段的無(wú)酶連接21, 而實(shí)現(xiàn)多片段圖3質(zhì)粒pRS MG A 的構(gòu)建17Figure 3C onstruction of the vector pRS MG A1. 5一步克隆法歐陽(yáng)平等18以四片段拼接的水稻單交換質(zhì)體載體pS MG A 表1幾種主要構(gòu)建方法的綜合比較T able 1C om paris on of several constructing methods方法傳統(tǒng)構(gòu)建法G ateway 技術(shù)適用情況通用通用優(yōu)點(diǎn)不受限制兩次反應(yīng)完成效率不穩(wěn)定高

26、一般高高限制因素酶切、連接需要合適位點(diǎn)不足多個(gè)片段時(shí)麻煩, 周期長(zhǎng)特點(diǎn)步驟多, 需要構(gòu)建中間載體多, 需要磷酸化、去磷酸化處理試劑盒操作得到入門(mén)載體和目的載體需要與其他手段結(jié)試劑盒價(jià)格高合獲得入門(mén)克隆需要田間篩選分離三段T -DNA 法農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共去除選擇標(biāo)記, 轉(zhuǎn)化法安全只適用于轉(zhuǎn)基因研需要得到種子進(jìn)行下一代植株分究的目的載體離, 得到無(wú)標(biāo)記植株多個(gè)大片段連接片段的正向引物中引入堿基, 利用T 4DNA 聚合酶多個(gè)小片段連接, 片段的正向引物中引入堿基復(fù)雜載體構(gòu)建法大片段載體構(gòu)建步驟相對(duì)少一步克隆法小載體構(gòu)建一次連接轉(zhuǎn)化簡(jiǎn)單載體構(gòu)建無(wú)優(yōu)需要與PCR 結(jié)合勢(shì)小于6kb 的序列, 不引入冗余堿

27、基需要與PCR 結(jié)合無(wú)酶連接則是今后載體構(gòu)建中最理想的一種思路和方法。綜上所述, 作者簡(jiǎn)要介紹了目前已經(jīng)成熟的幾種載體構(gòu)建技術(shù)的原理、特點(diǎn)和應(yīng)用。這些方法已經(jīng)在植物基因工程中發(fā)揮了重要作用。隨著植物分子生物學(xué)不斷的技術(shù)更新, 轉(zhuǎn)基因植物載體構(gòu)建必將朝著設(shè)計(jì)操作簡(jiǎn)便、安全、通用、高效、經(jīng)濟(jì)的方向發(fā)展。致謝:感謝東北師范大學(xué)細(xì)胞與遺傳研究所王興智教授對(duì)論文提出寶貴意見(jiàn)!參考文獻(xiàn):1Tenno T ,G oda N ,T ateishi Y,T ochio H ,et al. High -throught construction method for wxpression vector of re

28、ptides for NMR study suited for is otopic label 2ing J.Protein E ngDes Sel , 2004, 17(4 :305-314. 2008年18(5 生物技術(shù)872陳章良. 植物基因工程M.長(zhǎng)春:吉林省科學(xué)技術(shù)出版社,1994:67-68.3HartleyJ.L. , T em ple G. F. , and Brasch M. A. DNA cloning using in vitro site -specific recombinationJ.G enome R es , 2000,10(11 :1788-1795. 4徐化

29、學(xué), 熊建華, 傅彬英. 應(yīng)用G ateway 技術(shù)構(gòu)建水稻OsDAD1基因的RNA 干涉載體J.分子植物育種,2007,5(1 :133-136. 5G ATEW AY T M 一種新型克隆技術(shù)J.微生物學(xué)通報(bào),2000,27(5 :388.6楊美英, 賀紅霞, 王艷, 等. 番茄茄紅素-環(huán)化酶基因高效沉默載體構(gòu)建J.分子植物育種,2007,5(1 :43-46.7陳其軍, 安瑞, 周海夢(mèng), 等. 使用與G ateway 技術(shù)兼容的T 載體獲得入門(mén)克隆J.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2004,31(10 :951-954.8DeBM , Debrouwer D. T w o T -DNAs co

30、 -trans formed into Brassica napus by a double Agrobacterium in fection are mainly integrated at the same locusJ.Theor Appl G enet , 1991, 82:257-263. 9G leave A , M itra D. Mudge S , et al. Selectable marker -free transgenic plants without sexual crossing :transient expression of crerecombinase and

31、 use of a conditional lethal dom inant gene J.P lant Mol . Bio . , 1999, 40:223-235.10Ebinuma H , Sugita K, M atsunaga ,et al. Selection of marker -free genic plants using the is opentenyl trans ferase J.Sci USA , 1997, 94:2117-2121. 11G oldsbrough A , Y and subsequent elim genes tom oto J.Bio P T e

32、chnology , 1993(11 -1292. 12JohnI , Andrew Y, G oldsbrough P. T rans formation system for generating marker -free transgenic plantsJ.Bio P T echnology , 1994, (12 :263-267. 13Y ohichi W , M otoyasu O , K oh I ,et al. C o -integration , co -expression and co -segregation of an unlinked selectable mar

33、ker gene and NtFAD3gene in transgenic rice plants produced by particle bombardment J.G enes G enet Syst , 1998, 73:219-226.14Xing AQ , Zhang ZY, Shirley S ,et al. The use of the tw o T -DNA binary system to drive marker -free transgenic s oybeansJ.I n vitro Cell Dev Biol P lant , 2000, 36:456-463.15

34、ShirleyS ,X ing AQ , Y e XG,et al. Production of -linolenic acid and stearidonic acid in seeds of marker -free transgenic s oybean J.Crop Sci , 2004, 44:646-652.16葉興國(guó), 秦華. 通過(guò)構(gòu)建三段T -DNA 載體高頻率獲得無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因大豆植株的研究J.生物工程學(xué)報(bào), 2007,23(1 :138-144.17陸云華, 馬立新, 蔣思婧. 一種通用高效的復(fù)雜載體構(gòu)建的新方法J.遺傳,2006,28(2 :212-218.18歐陽(yáng)平, 李

35、玉, 嚴(yán)紅, 等. :一步克隆法J.湖北大學(xué)學(xué)報(bào),2007(2 181. 19T z , uo -, t , et al. pS AT vectors :a m ids tagging and expression of Biology , 2005, 57:503-516. 20W. Earley , Jeremy R. Haag , Olga P ontes , et al. Pikaard ,G ateway com patible vectors for plant functional genom ics and proteom ics J .The P lant Journal ,

36、2006, 45:616-629.21Stols Lucy , G u M in yi. A new vector for high throughput , ligation inde 2pendent cloning encoding a tobacco etch virus protease cleavage site J.Pro 2tein Expression and Purification , 2002, 25:8-15.微衛(wèi)星標(biāo)記在綿、山羊親緣關(guān)系分析中的應(yīng)用常新建, 岳文斌, 任有蛇, 趙俊星(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 山西太谷030801摘要:為了進(jìn)一步了解微衛(wèi)星標(biāo)記在綿

37、、山羊親緣關(guān)系分析中的應(yīng)用, 該文簡(jiǎn)要介紹了微衛(wèi)星標(biāo)記的原理和特點(diǎn), 詳述了近年來(lái)微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)在綿羊、山羊親緣關(guān)系研究中的應(yīng)用進(jìn)展以及存在的問(wèn)題, 并提出了當(dāng)前研究的建議。關(guān)鍵詞:微衛(wèi)星標(biāo)記; 親緣關(guān)系; 綿羊; 山羊; 應(yīng)用進(jìn)展中圖分類(lèi)號(hào):Q751;Q789文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1004-311X (2008 05-0087-033Application of Microsatellite Markers on Analyzing the G eneticR elationship on Sheep and G oat BreedsCH ANG X in -jian ,Y UE Wen

38、-bin ,RE N Y ou -she ,ZH AO Jun -xing(C ollege of Animal Science and T echnology ,Shanxi Agricultural University ,T aigu 030801,China 3Abstract :Onthis paper , the principles and traits of M icrosatellite were introduced to get a further acknowledgement about the present applicationof M icrosatellite on the analysis of genetic relationship on Sheep and G oat breeds. The development of the M icrosatell