微生物發(fā)酵飼料中乳酸含量的測定方法比較分析

1、微生物發(fā)酵飼料中乳酸含量的測定方法比較分析摘要：通過比較分析羥基聯(lián)苯比色法、EDTA定鈣法、乳酸脫氫酶法3種檢測方法的準(zhǔn)確性、簡便性、經(jīng)濟(jì)性，找到適合于測定微生物發(fā)酵飼料中乳酸含量的方 法。試驗結(jié)果表明，乳酸脫氫酶法檢測的準(zhǔn)確性最好、迅速，但成本高； EDTA 定鈣法檢測雖然簡便、迅速，但準(zhǔn)確性最差；羥基聯(lián)苯比色法檢測效果居中，較 為準(zhǔn)確和方便。因此，乳酸脫氫酶法適合于高精度、高效率的檢測；EDTA定鈣法適合于迅速簡便、精度要求不高的檢測；羥基聯(lián)苯比色法可作為企業(yè)或科研單位 精度要求不高的常規(guī)檢測。關(guān)鍵詞：發(fā)酵飼料；乳酸；羥基聯(lián)苯比色法；EDTA定鈣法；乳酸脫氫酶法Comparative An

2、alysis of Analytical Methods of Lactic AcidContent in Microbial Fermentation FeedsAbstract:To find a method that was used to measure the lactic acid content in microbial fermentation feeds,the accuracy, convenient and economy of hydroxybiphenol colorimetry method, EDTA titration method and lactic ac

3、?id dehydrogenase method were contrasted in this study. The results showed that the accuracy of the test result wasbest and rapid using the lactic acid dehydrogenase method, but the costwas higher. The test of EDTA titration meth?od was simple and rapid, but the accuracy was worst. The test results

4、of hydroxybiphenol colorimetry method was preferably, the methods had good specificity and convenient. Consequently, lactic acid dehydrogenase method wasfit for the tests require high precision and high efficiency. The EDTAtitration method was fit for the tests requiresimple and rapid, but the accur

5、acy didn t ask for much. The hydroxybiphenol colorimetry method was used for rou ?tine undemanding accuracy test result in enterprise or institutes of scientific research.Key words: microbialfermentationfeeds;lacticacid;hydroxybiphenolcolorimetrymetho d;EDTAtitrationmeth ?od;lacticaciddehydrogenasem

6、ethod收稿日期：2012-03-22 基金項目：龍巖市科技計劃重點項目(2011LY18) 作者簡介：羅建(1962)，男，福建龍巖人，碩士，研究方向為飼料的研發(fā)、生產(chǎn)與應(yīng)用。* 通訊作者：教授，碩士生導(dǎo)師，E-mailLyyxy198837 飼料博覽 2012 年第 5 期 檢測分析 微生物發(fā)酵飼料的生產(chǎn)與應(yīng)用是近年來飼料工 業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)最熱門的話題之一。隨著人民生活水平 的不斷提高和環(huán)境資源的日益惡化，利用農(nóng)副產(chǎn)品 和輕工副產(chǎn)物生產(chǎn)高質(zhì)量、無污染的微生物發(fā)酵飼 料已成為緩解飼料資源短缺、提高畜禽產(chǎn)品品質(zhì)、 減少畜產(chǎn)品藥物抗生素殘留的重要手段。微生物發(fā)酵飼料的生產(chǎn)菌種主要有乳酸菌、酵母菌和

7、芽孢 菌，其中乳酸菌包括發(fā)酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌和糞 腸球菌3種 2 。乳酸菌是發(fā)酵的主角，其在厭氧條 件下大量繁殖占支配地位時產(chǎn)生大量的乳酸，抑制 其他不良微生物的生長繁殖，從而制成了優(yōu)質(zhì)的微 生物發(fā)酵飼料 3 。因此，發(fā)酵飼料中乳酸含量的高 低是判斷微生物發(fā)酵飼料品質(zhì)優(yōu)劣的一個重要指 標(biāo)。目前，乳酸含量的測定方法主要有羥基聯(lián)苯比 色法、EDTA定鈣法、高效液相色譜法（HPLC）、酶法等，均有各自的適用范圍和優(yōu)缺點 4-7 。本文 通過比較分析微生物發(fā)酵飼料中不同乳酸測定方 法，以期得到適合于中小型飼料廠或科研單位快 速、簡便檢測產(chǎn)品乳酸含量的方法。1 材料與方法1.1 試驗材料微生物發(fā)酵飼料

8、由福建省龍巖市金和動物飼料 有限公司提供。在規(guī)定的發(fā)酵時間內(nèi)發(fā)酵完成后取 樣品1g，測定其乳酸含量。1.2 乳酸測定方法1.2.1羥基聯(lián)苯比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別配置乳酸標(biāo)準(zhǔn)液14、5、6 口 g mL-1，在比色管中分別加入乳酸標(biāo)準(zhǔn)液1 mL、4.0%硫酸銅溶液0.05 mL，再加入濃硫酸6 mL，反應(yīng)5 min，冷卻至20 C以下后， 再分別于各比色管中加入 1%堿溶性羥基聯(lián)苯溶液0.05 mL ，混合均勻，在室溫下放置 68 h，過夜，在570 nm下進(jìn)行比色測定，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線 8 。樣品測定：1 g發(fā)酵飼料溶解于100 mL 蒸餾水 中，4 000 rpm離心10 min，取上清液

9、1 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品中乳酸含量（ %）。1.2.2 EDTA 定鈣法 稱取樣品 1 g（準(zhǔn)確至0.0002 g）于100 mL 杯 中，加水 80 mL，在電爐上加熱至近沸，繼續(xù)加熱5 min（溶液不要溢出），冷卻，定容至100 mL，待溶液澄清后（或過濾） ，吸取上清液（濾液）10 mL 于錐形瓶中，加三乙醇胺10 mL 、蒸餾水50 mL200 g L-1氫氧化鈉溶液10 mL 、鹽酸羥胺0.5 g 搖勻 后，再加鈣混合指示劑少許，立即用 EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶 液0.05 moL L-1 滴定，溶液呈現(xiàn)純藍(lán)色為滴定終 點。乳酸的測定結(jié)果計算公式見式（1 ）。乳酸濃度（g L-1 ）=90

10、.08 x CXV（1） 式中，V 為滴定所消耗EDTA 溶液體積（mL）；C 為EDTA 濃度（moL-L-1 ）；90.08 為乳酸的摩爾質(zhì)量。 為便于與其他方法測定結(jié)果比較，乳酸的測定 結(jié)果最終轉(zhuǎn)換成每克飼料乳酸含量（% ）。1.2.3乳酸脫氫酶法 酶法測定乳酸含量操作步驟見表1。 酶法乳酸檢測試劑盒購自南京建成生物工程有 限公司，按照其使用說明，預(yù)先配置好酶工作液和 反應(yīng)顯色劑（標(biāo)準(zhǔn)液和終止液試劑盒中已配好，直 接使用）。取飼料樣品1g 溶解于50 mL蒸餾水中，4 000 rpm離心10 min，取上清液待測，蒸餾水調(diào) 零，測定波長為530 nm。測定結(jié)果計算公式見式（2 ）。 式中

11、，C為樣品濃度mmoL L-150為樣品稀釋倍數(shù)。同理，乳酸的測定結(jié)果最終轉(zhuǎn)換成每克飼料乳 酸含量（%）。2 結(jié)果與分析2.13種方法測定發(fā)酵飼料乳酸含量 分別采用羥基聯(lián)苯比色法、EDTA定鈣法、乳酸脫氫酶法測3種方法對同一發(fā)酵批次的微生物發(fā) 酵飼料進(jìn)行測定，取樣3 批、每批重復(fù)3次，進(jìn)行 統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果見表2。 試劑 蒸餾水3 mmoL-L-1 標(biāo)準(zhǔn)液 樣本 酶工作液 顯色劑 混勻，37 C水浴準(zhǔn)確反應(yīng)10 min 終止液 加樣管 空白管 0.020.22 標(biāo)準(zhǔn)管0.0210.22測定管0.0210.22表 1 酶法測定乳酸含量操作步驟 mL乳酸濃度(mmoL L-1)(2)382012年

12、第 5 期 飼料博覽檢測分析由表2可知，同一批次間和不同批次間檢測， 平均誤差最小的方法是乳酸脫氫酶法，最差的是 EDTA定鈣法；對于同一批次檢測結(jié)果，羥基聯(lián)苯 比色法和乳酸脫氫酶法檢測結(jié)果差異不顯著( P >0.05)，而與EDTA定鈣法差異顯著( P<0.05)。2.23種方法測定發(fā)酵飼料乳酸含量應(yīng)用性分析3種方法測定發(fā)酵飼料乳酸含量應(yīng)用分析結(jié)果見表3。由表3可知，3種方法中，乳酸脫氫酶法檢測 的準(zhǔn)確性最好，操作也最為簡便，且檢測時間也最 短，但成本較為昂貴；EDTA定鈣法雖然操作簡 便，檢測時間也不太長，但檢測準(zhǔn)確性最差，誤差 較大，結(jié)果較不可靠；羥基聯(lián)苯比色法檢測效果處 于

13、另外兩個方法之間，檢測較為準(zhǔn)確和方便。3 討論 發(fā)酵飼料中乳酸含量的高低是判斷其產(chǎn)品品質(zhì) 優(yōu)劣的一個非常重要指標(biāo)，但目前我國對飼料中乳 酸含量的測定方法報道較少。本文探討了3種檢測 發(fā)酵飼料中乳酸含量的方法，結(jié)果表明，乳酸脫氫 酶法檢測的準(zhǔn)確性最好、迅速，但成本較高，該方 法適用于某特定時期抽檢樣品，需迅速得到準(zhǔn)確結(jié) 果的場合；EDTA定鈣法檢測的準(zhǔn)確性最差，但操 作簡便、迅速，只適用于只需得到檢測樣品乳酸含 量大概數(shù)值的場合；羥基聯(lián)苯比色法檢測效果居 中，可作為企業(yè)或科研單位精度要求不高的常規(guī)檢 測發(fā)酵飼料樣品中乳酸含量的一種方法。發(fā)酵液中乳酸含量的測定方法還有HPLC法、 生物傳感器法等。

14、這兩種方法檢測結(jié)果可靠、快捷 迅速、專業(yè)性強(qiáng)，并可同時檢測產(chǎn)品中其他物質(zhì) （如有機(jī)酸、葡萄糖等）的含量。樊永紅試驗結(jié)果表 明，在同一發(fā)酵批次的乳酸含量測試中，EDTA 定鈣法與HPLC法、生物傳感儀法有顯著差異( P<0.05)，而HPLC法與生物傳感儀法無顯著性差異(P>0.05)；EDTA定鈣法簡便快速，但重復(fù)性差；HPLC法準(zhǔn)確、靈敏；生物傳感儀測定法比較準(zhǔn)確和 方便 9 。如發(fā)酵飼料生產(chǎn)企業(yè)有財力購置相關(guān)的設(shè) 備，此方法也可作為微生物發(fā)酵飼料中乳酸含量的 檢測方法，檢測結(jié)果可能更為真實可靠。 參 考 文 獻(xiàn) 1 陸文清發(fā)酵飼料生產(chǎn)與應(yīng)用技術(shù)M.北京中國輕工業(yè)出版 社, 20

15、11. 2 林標(biāo)聲J羅建J戴愛玲微生物發(fā)酵飼料對斷奶仔豬生長性能的影響J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38（5）: 2 378-2 380. 3 余伯良發(fā)酵飼料生產(chǎn)與應(yīng)用新技術(shù)M.北京中國農(nóng)業(yè)出版社, 1999. 4 高慶J印建和J穆華容對羥基聯(lián)苯法測定啤酒中乳酸J.釀酒, 2005（6）: 93-95. 5 鄭志J姜紹通J潘麗軍. EDTA定鈣法測定發(fā)酵液中乳酸含量的 探討J.食品科學(xué), 2003, 24（3）: 102-105. 6 白冬梅J班睿J趙學(xué)明反相高效液相色譜法測定米根霉乳 酸發(fā)酵液中的乳酸J. 色譜 , 2000, 18 （6） : 527-528. 7 柳暢先 度潯吳士鈞 酶

16、法測定乳酸J. 分析試驗室 , 2005, 24 （9）: 75-77. 8 梁瓊J魯明波J盧正東對羥基聯(lián)苯法定量測定發(fā)酵液中的 乳酸J. 食品科學(xué) , 2008, 29 （ 6 ） : 357-360.樊永紅王麗J柳丹米根霉發(fā)酵液中乳酸含量的測定方法 研究J.生物技術(shù), 2007, 17(1): 54-55.注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著( P <0.05)，肩標(biāo)不同大寫字母者表示差異極顯著( P<0.01)，肩標(biāo)相同寫字母或不標(biāo)注者 表示差異不顯著( P>0.05)。提取方法羥基聯(lián)苯比色法EDTA 定鈣法乳酸脫氫酶法 準(zhǔn)確性 較好 最好 成本 居中 便宜日蟲昂貴 操作繁簡 較繁瑣 簡便 簡便 檢測時間 較長 適中 很短 測定方法 羥基聯(lián)苯比色法 EDTA 定鈣法