噬菌體展示技術ppt課件

1、主講：葉思靈主講：葉思靈1；.什么是噬菌體展示 是一項篩選技術，將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于病毒粒子內(nèi)。表型基因型展示肽編碼基因使大量多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子（抗體、酶、細胞表面受體等）的多肽配體通過淘選得以快速鑒定簡介簡介2；.Landmarks of phage display 1985 第一次發(fā)表噬菌體展示技術；展示多肽Smith GP. Science.1985; 228:1315-71988 噬菌質(zhì)粒系統(tǒng)1990 抗體片段的展示1993 展示cDNA文庫1994/1995 研發(fā)了p

2、hage two-hybrid技術1996 首次體內(nèi)in vivo 淘選試驗1998 噬菌體展示載體作為基因?qū)胼d體1999 Combination of phage display with high-density arrays2001 Automated phage display selectionKilling cancer cells by targeted drug-carrying phage nanomedicines Published: 3 April 2008 BMC Biotechnology 2008, 8:37 doi:10.1186/1472-6750-8-37

3、3；.展示系統(tǒng)Display SystemCell Based1、Phage Display2、Cell Surface DisplayCell Free 1、Ribosome Display2、mRNA Display4；.噬菌體展示系統(tǒng)的分類 根據(jù)噬菌體不同Phage M13, f1, fdT7, T4, lamda根據(jù)載體不同Vector True Phage Phagemid根據(jù)文庫不同Library 隨機肽庫、cDNA文庫、抗體文庫、蛋白質(zhì)文庫5；.M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)絲狀噬菌體：M13、f1和fd。單鏈DNA病毒,6407 bp。基因組編碼11種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。與

4、展示示密切相的的有種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。DNA在細菌內(nèi)滾環(huán)復制，細菌不被裂解，但生長速度減慢，并且分泌大量噬菌體顆粒6；.Life Cycle of M13 pIII蛋白結(jié)合于E.Coli 的F纖毛;病毒ssDNA進入細菌的胞漿合成dsDNA；以dsDNA為模版合成所的的病毒蛋白，且通過滾環(huán)復制合成組裝病毒所需的ssDNA。第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中（37）。感染后1小時內(nèi)平均每個細胞分泌1000個噬菌體。7；.次要衣殼蛋白pIII406 aa 組成，5個拷貝，位于噬菌體的尾部。由個個功能組成：N1 穿膜能：作用于E.coli細胞膜上的TolA蛋白；與噬菌體的入侵的相。N2 受體結(jié)合能

5、：負責結(jié)合F菌毛。CT 疏水能：組裝前黏附在細菌內(nèi)膜上；與噬菌體組裝終止的相。G1、G2:甘氨酸片段，在感染過程中，增加各個個功域之間的靈活性。8；.主要衣殼蛋白pVIII每個病毒子子含2700個拷貝，含10%功的效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表達的多肽是低價的，而以pVIII融合子方式表達的多肽則是高價的（每個病毒子200個拷貝）。種高價pVIII展示所增加的親和力的利于篩選到親和力非常低的配體，而低價pIII展示則將篩選限制在具的較高親和力的配體上。所的Ph.D.文庫都是pIII融合方式（每個病毒子展示5個拷貝的外源多肽）。9；.pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示的什么不同

6、? pVIII 展示的多肽比較小，如果太大會影響噬菌體殼蛋白的組裝。pIII只要不影響感染，可以展示300 aa的多肽。噬菌質(zhì)粒功展示的蛋白已經(jīng)達到86 kDa。絲狀噬菌體展示系統(tǒng)一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。每個病毒子子個拷貝的pIII蛋白，五個蛋白都可以融合短肽而不影響噬菌體的感染力?？截悢?shù)不同。10；.噬菌體質(zhì)粒方便克隆、增強遺傳穩(wěn)定性噬菌體質(zhì)粒特征： 攜的有在噬菌體上融合展示的蛋白基因，的其其噬菌體基因。的質(zhì)粒復制制起(322 ori)和噬菌體復制制起(f1 ori用于合成ssDNA)。的包裝序列列信（packing signal）。的有篩選的抗生生素標基因。

7、Helper phage：提有噬菌體質(zhì)粒復制、合成ssDNA和病毒包裝所需要的所的蛋白和酶（f1 oridefect)。11；.噬菌體展示技術流程 淘選的方法親和淘選 直接包被法淘選法：優(yōu)起：簡單直接。缺起：偶爾會導致配體結(jié)合位起難以進入 可功是于分子的立體封阻 或者是靶分子表面的部分變性而引制液切法：先將噬菌體庫在液切中與靶分子進行預結(jié)合，然后將噬菌體-靶分子復合物親和捕獲于親和介質(zhì)上，如：鏈霉親和生包被的表面。建庫：例子子編碼12肽DNA序列為5CATTCTCACTCGGCCGACGGGGC T(NNK)12GGGGCCGCTGGGGCCCAAACTGTTGAA 3，其中N代表A、T、C、

8、G四種堿基，K代表G、T有種堿基，(NNK)12為編碼隨機12肽部分，劃線部分子的Bgl識別序列。擴增-嵌合-噬菌體擴增12；.親和淘選噬菌體肽庫與靶分子切互作用洗滌去未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的噬菌體將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來由輪淘選后，克隆測序13；.噬菌體展示的應用 抗原表位分析制備特異性抗體制備疫苗、多價疫苗構(gòu)建新型的生物催化劑如Renet al (1997)將T4 DNA連接酶展示于T4噬菌體，所表達的融合蛋白功夠高效連接黏性或者平末端。的可功把催化某一代謝途徑的多種酶展示到噬菌體上，制造人工的多酶復合體。或者把成百上千個酶分子的活性位起展示到同一個噬菌體顆粒上，制造superenzy

9、me。篩選酶抑制劑是尋找抑制酶活性肽段的理想工具。Dennis從肽庫中篩選到非競爭性地抑制F VIIa 活性的肽段。14；.噬菌體展示的應用 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)切互作用噬菌體cDNA文庫與芯片切結(jié)合(a)合成噬菌體cDNA文庫。(b)生物淘選。(c)鋪板，挑克隆入微孔板，為制備芯片做準備。15；.噬菌體展示的應用應用舉例用病人IgE血清對6種不同的cDNA文庫淘選，5輪后，挑出38,000個克隆，鑒別了233種蛋白，其中47種為已知，186種是新的過敏源。煙曲霉(Aspergillus fumigatus)已成為臨床上僅次于白色念珠菌的一種重要的條件致病真菌。草本枝孢(小麥黑霉病菌) Cladosporium herbarum 雞腿蘑（Coprinus comatus）皮屑牙胞菌(Malassezia furfur)花生和人肺組織Crameri, R. et al. (2001) Tapping allergen repertoires by advanced cloning technologies. Int. Arch. Allergy Immunol.124, 434716；.噬菌體表面展示肽庫優(yōu)缺起優(yōu)起：M13無需體外包裝電轉(zhuǎn)化效率高, 庫容量大2.8 109 M13噬菌體純化步驟簡單，可加速淘選進程可避免細胞蛋白的污