第六章基因克隆張幻燈片

1、1第六章 基因克隆的技術(shù)路線2基因工程基因工程（上游）（上游）大體步驟大體步驟獲取目的基因獲取目的基因目的基因與載體連接目的基因與載體連接連接產(chǎn)物導(dǎo)入細(xì)胞連接產(chǎn)物導(dǎo)入細(xì)胞目的基因表達(dá)目的基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR法法PCR法法直接調(diào)用法直接調(diào)用法各種質(zhì)粒各種質(zhì)粒各種病毒各種病毒皆經(jīng)改造皆經(jīng)改造原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞植物細(xì)胞3第一節(jié)獲得目的基因41. 直接分離目的直接分離目的DNA 經(jīng)限制酶切割，電泳、分離經(jīng)限制酶切割，電泳、分離DNA片段。片段。 適用于獲得細(xì)菌、質(zhì)粒、病毒等低等生物適用于獲得細(xì)菌、質(zhì)粒、病毒等低等生物的基因片段。的基因片段。 真核生物

2、的染色體真核生物的染色體DNA中含有內(nèi)含子中含有內(nèi)含子序列，不適合于基因工程的需要。序列，不適合于基因工程的需要。52. cDNA文庫(kù) 以以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成的互補(bǔ)為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成的互補(bǔ)DNA。以此得到的某種細(xì)胞內(nèi)所有。以此得到的某種細(xì)胞內(nèi)所有mRNA的的cDNA，稱為，稱為cDNA文庫(kù)。文庫(kù)。63 3. RT-PCR基本原理：基本原理：將細(xì)胞中將細(xì)胞中mRNA逆轉(zhuǎn)錄為逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以，以cDNA為模板，進(jìn)行為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)。mRNAcDNAPCR產(chǎn)物產(chǎn)物 不論用哪種方法，目的是得到不含內(nèi)不論用哪種方法，目的是得到不含內(nèi)含子的含子的DNA序列。序列。78第二節(jié)第二節(jié)

3、重組重組DNA分子的構(gòu)建分子的構(gòu)建9 Link of cohesive end粘末端連接一一.目的基因與載體的連接10Link of blunt end平末端連接11平末端連接平末端連接Recombinant DNAT4 DNA ligasevector1 連接反應(yīng)的實(shí)際反應(yīng)溫度為連接反應(yīng)的實(shí)際反應(yīng)溫度為4160C。160C時(shí)，需時(shí)，需4小時(shí)，若小時(shí)，若40C時(shí)，需過(guò)夜。時(shí)，需過(guò)夜。 平末端連接反應(yīng)效率低。為提高反應(yīng)平末端連接反應(yīng)效率低。為提高反應(yīng)效率，可采用平末端加尾巴的辦法，將平效率，可采用平末端加尾巴的辦法，將平末端改造成粘末端。末端改造成粘末端。1213平末端連接的缺點(diǎn)*more di

4、fficult ligation 連接困難*2-direction insertion 雙向插入*self-reconnection 自身環(huán)化*no easy way of retrieving the insert 重新篩選插入的片斷困難14vector12vector12AABAB 平齊末端連接時(shí)，插入的方向是隨機(jī)的，稱為雙向插入。會(huì)給后續(xù)的工作造成很多麻煩。15EcoRIEcoRI單酶切粘末端連接單酶切粘末端連接1617單酶切粘末端連接的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)*Using the same one enzyme to cut 用同一種酶切 *Ligated easily and coveniently

5、 連接容易方便缺點(diǎn)*Self-reconnection of vector 載體自身環(huán)化 *Inserted in two directions 雙向插入雙向插入18單酶切粘末端的雙向插入GCTTAAAATTC GAATTC GGCTTAAGCTTAAAATTC GGCTTAAAATTC G19AATTCxxxxxxA GxxxxxxTTCGAG AGCTTCTTAA AGAATTCxxxxxxAAGCTTCTTAAGxxxxxxTTCGAAligase雙雙酶酶切切粘粘末末端端連連接接EcoRI HindIIIEcoRI HindIII20雙酶切粘末端連接的特點(diǎn) *Using the same

6、 two enzymes to cut *Ligated easily and conveniently *no self-reconnection of vector *Inserted in one direction 定向插入 缺點(diǎn) 操作比較麻煩。如果兩種酶要求的條件不同，需要進(jìn)行兩個(gè)階段的反應(yīng)。21幾種實(shí)驗(yàn)方法 利用相應(yīng)的技術(shù)方法，使實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。22Link of homopolymeric tails 添加同聚尾避免質(zhì)粒的自身環(huán)化末端轉(zhuǎn)移酶23添加接頭，引入限制酶的切割添加接頭，引入限制酶的切割位點(diǎn)，然后用相應(yīng)的酶切割。位點(diǎn)，然后用相應(yīng)的酶切割。24野生型細(xì)菌具有針對(duì)外源野生型細(xì)菌

7、具有針對(duì)外源DNA的限制和的限制和修飾系統(tǒng)，會(huì)切割外源修飾系統(tǒng)，會(huì)切割外源DNA分子。因此用于分子。因此用于基因工程的受體菌，需經(jīng)篩選和人工改造?；蚬こ痰氖荏w菌，需經(jīng)篩選和人工改造。第三節(jié)第三節(jié) 重組子導(dǎo)入細(xì)胞重組子導(dǎo)入細(xì)胞25 外源外源DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞的過(guò)程叫做轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)入細(xì)胞的過(guò)程叫做轉(zhuǎn)化。 但但不包括由病毒介導(dǎo)的不包括由病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入 。常用的。常用的方法有如下：方法有如下：26The first is a chemical method utilizing CaCl2 and heat shock to promote DNA entry into cells. 氯化鈣法氯化鈣

8、法 ：利用氯化鈣和熱休克使受體菌：利用氯化鈣和熱休克使受體菌成為感受態(tài)細(xì)胞，促進(jìn)外源成為感受態(tài)細(xì)胞，促進(jìn)外源 DNA的進(jìn)入。的進(jìn)入。 27 宿主細(xì)胞與重組宿主細(xì)胞與重組DNA在在00C的低滲氯化鈣的低滲氯化鈣溶液中孵育，快速轉(zhuǎn)入溶液中孵育，快速轉(zhuǎn)入420C造成熱休克。經(jīng)造成熱休克。經(jīng)此處理后的細(xì)胞此處理后的細(xì)胞“容易容易”接受外源的接受外源的DNA，一般叫做感受態(tài)細(xì)胞。一般叫做感受態(tài)細(xì)胞。28處理宿主細(xì)胞處理宿主細(xì)胞1. 低滲溶液熱休克低滲溶液熱休克 E.coli + 0.1M CaCl2 competent cells (E.coli) 被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞Low-osmosis

9、 makes cell expanding0-4Recombinant DNA + 42 Heat makes cell more expanding and membrane more permeable29 處于感受態(tài)的細(xì)菌表面正電荷增加，處于感受態(tài)的細(xì)菌表面正電荷增加，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)有改變，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)有改變， 通透性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)通透性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)化子易于進(jìn)入細(xì)胞?；右子谶M(jìn)入細(xì)胞。30其他處理受體細(xì)胞的方法 利用二甲基亞砜（利用二甲基亞砜（DMSO）處理細(xì)胞）處理細(xì)胞 二巰基蘇糖醇（二巰基蘇糖醇（DTT）處理細(xì)胞。）處理細(xì)胞。 利用聚乙二醇（利用聚乙二醇（PEG）處理細(xì)胞。）處理細(xì)胞。31Whe

10、n competent cells are mixed with DNA， some cells (actually, very few) become transformed: they acquire recombinant vector DNA. Pseudo-positivepositive32 第四節(jié) 重組子的篩選與鑒定33After transformation，only a few cells take up the plasmid DNA，and there only has one recombinant molecule in one recipient cell(受受體細(xì)

11、胞體細(xì)胞)，so a method is needed for selecting those 轉(zhuǎn)化步驟后，轉(zhuǎn)進(jìn)重組質(zhì)粒的細(xì)胞是較轉(zhuǎn)化步驟后，轉(zhuǎn)進(jìn)重組質(zhì)粒的細(xì)胞是較少的。因此需要挑選出含有重組子的細(xì)胞。少的。因此需要挑選出含有重組子的細(xì)胞。341. Direct selection 直接篩選直接篩選Antibotic resistance 抗菌素抗性抗菌素抗性Marker rescue selection 借助顏色篩選借助顏色篩選In situ hybridization 原位雜交原位雜交2. Immunology selection 免疫篩選免疫篩選Immunochemistry metho

12、d 免疫化學(xué)免疫化學(xué)Enzyme immunodetection assay 酶免疫分析酶免疫分析35 質(zhì)粒載體帶有氨芐青霉素抗性基因，質(zhì)粒載體帶有氨芐青霉素抗性基因，在宿主細(xì)胞內(nèi)該抗性基因表達(dá)出可水解氨在宿主細(xì)胞內(nèi)該抗性基因表達(dá)出可水解氨芐青霉素的酶，因而宿主細(xì)胞可在含氨芐芐青霉素的酶，因而宿主細(xì)胞可在含氨芐青霉素的瓊脂糖平板上生長(zhǎng)。青霉素的瓊脂糖平板上生長(zhǎng)。利用抗生素抗性篩選利用抗生素抗性篩選36復(fù)制起點(diǎn)氨芐青霉素抗性基因3738392.利用顏色篩選 插入失活現(xiàn)象X-gal ：5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-B-D-半乳糖苷半乳糖苷40多克隆位點(diǎn)半乳糖苷酶的基因內(nèi)有多克隆位點(diǎn)，酶切插入外

13、源DNA后，該基因無(wú)法表達(dá).4142 完整的LacZ基因內(nèi)，經(jīng)過(guò)改造加入了多克隆位點(diǎn)，但并不影響LacZ基因的表達(dá)。 當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，完整的LacZ基因表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)菌的有關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物共同組成有功能的半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，該酶把無(wú)色的X-gal切割成半乳糖和藍(lán)色的5溴4氯靛藍(lán)，使得菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。43表示外源基因插入編碼半乳糖苷酶的基因區(qū)段44Target gene4546藍(lán)色菌落藍(lán)色菌落無(wú)插入序列無(wú)插入序列白色菌落含插入序列轉(zhuǎn)化菌具有氨芐青霉素抗性，可在 加有氨芐青霉素的平板上生長(zhǎng)。47 使用含Amp+X-Gal的瓊脂糖平板篩選克隆，可能出現(xiàn)三種情況。 1 . 載體自身環(huán)化，產(chǎn)生藍(lán)色菌落；

14、 2 帶有正確插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，不能生長(zhǎng)。483. In situ hybridization 原位雜交原位雜交 生長(zhǎng)在瓊脂糖平板上的菌落，可定點(diǎn)轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)在瓊脂糖平板上的菌落，可定點(diǎn)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，加入放射性的探針（即帶有硝酸纖維素膜上，加入放射性的探針（即帶有 放放射性的與目的片斷互補(bǔ)的核酸片斷），與菌落雜射性的與目的片斷互補(bǔ)的核酸片斷），與菌落雜交。經(jīng)洗滌后的膜與交。經(jīng)洗滌后的膜與X光膠片作用，挑選出陽(yáng)光膠片作用，挑選出陽(yáng)性克隆。性克隆。4950DNA hybridization 515253545556免疫法篩選 外源基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出的蛋白質(zhì)

15、，可與特異性的抗體結(jié)合。57利用抗體篩選利用抗體篩選原理原理 目的基因編碼的蛋白質(zhì)作為抗原，用特異目的基因編碼的蛋白質(zhì)作為抗原，用特異性抗體與之反應(yīng)，再根據(jù)顏色等變化，篩選出菌性抗體與之反應(yīng)，再根據(jù)顏色等變化，篩選出菌落。落。方法方法 在瓊脂平板上的菌落，轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜上，在瓊脂平板上的菌落，轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜上，若某菌落帶有目的基因，并可表達(dá)該目的基因所若某菌落帶有目的基因，并可表達(dá)該目的基因所編碼的蛋白質(zhì)，則加入該蛋白質(zhì)的特異抗體，可編碼的蛋白質(zhì)，則加入該蛋白質(zhì)的特異抗體，可與該菌落結(jié)合，附著在濾膜上，不會(huì)被洗掉。該與該菌落結(jié)合，附著在濾膜上，不會(huì)被洗掉。該抗體可攜帶酶或熒光，易于檢測(cè)?？贵w可

16、攜帶酶或熒光，易于檢測(cè)。58Screening with antibodies is used when cloned gene is expressed and antibodies recognizing the encoded protein are available. 59第五節(jié) 基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定60基因表達(dá)基因表達(dá) 基因表達(dá)指某基因在細(xì)胞中基因表達(dá)指某基因在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄為轉(zhuǎn)錄為mRNA繼而翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程。繼而翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程。DNARNAProtein轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯61研究基因表達(dá)的手段研究基因表達(dá)的手段1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA

17、) 3、Western blot (蛋白質(zhì)）蛋白質(zhì)） 4、免疫組化、免疫組化 （蛋白質(zhì)）（蛋白質(zhì)）621、RT-PCR基本原理：基本原理：將細(xì)胞中將細(xì)胞中mRNA逆轉(zhuǎn)錄為逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以，以cDNA為模板，進(jìn)行為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。根據(jù)反應(yīng)。根據(jù)PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的量，判斷基因表達(dá)的強(qiáng)度。量，判斷基因表達(dá)的強(qiáng)度。mRNAcDNAPCR產(chǎn)物產(chǎn)物632、Northern blot標(biāo)記探針與膜固相標(biāo)記探針與膜固相RNA雜交。雜交。根據(jù)雜交信號(hào)強(qiáng)弱判斷表達(dá)量，根據(jù)雜交信號(hào)強(qiáng)弱判斷表達(dá)量，根據(jù)雜交信號(hào)位置判斷分子長(zhǎng)度。根據(jù)雜交信號(hào)位置判斷分子長(zhǎng)度。雜交信號(hào)雜交信號(hào)64實(shí)驗(yàn)操作：實(shí)驗(yàn)操作：1）RNA提

18、取提取2）RNA電泳（分離不同長(zhǎng)度電泳（分離不同長(zhǎng)度RNA)3）轉(zhuǎn)膜）轉(zhuǎn)膜 (形成固相形成固相RNA)4）探針標(biāo)記（同位素）探針標(biāo)記（同位素/非同位素）非同位素）5）雜交）雜交6）洗膜）洗膜7）顯影（放射性）顯影（放射性/酶促反應(yīng)）酶促反應(yīng)）65Northern blot 特點(diǎn)：特點(diǎn)：因?yàn)闆](méi)有擴(kuò)增過(guò)程，因?yàn)闆](méi)有擴(kuò)增過(guò)程，Northern blot 的的結(jié)果可靠性高。可以確定未知基因的結(jié)果可靠性高?？梢源_定未知基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）長(zhǎng)度。）長(zhǎng)度。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：1、操作煩瑣、操作煩瑣2、使用同位素可能污染環(huán)境、使用同位素可能污染環(huán)境3、靈敏度低、靈敏度低4、對(duì)、對(duì)RNA質(zhì)量要求高質(zhì)量要求高663、Western blot標(biāo)記抗體與固定在膜上的蛋白作用。標(biāo)記抗體與固定在膜上的蛋白作用。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱判斷蛋白表達(dá)強(qiáng)度。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱判斷蛋白表達(dá)強(qiáng)度。根據(jù)信號(hào)位置判斷蛋白分子量。根據(jù)信號(hào)位置判斷蛋白分