高三尖杉酯堿誘導(dǎo)急性白血病原代細(xì)胞凋亡的觀察

1、    高三尖杉酯堿誘導(dǎo)急性白血病原代細(xì)胞凋亡的觀察        摘要：目的觀察高三尖杉酯堿(HHar)誘導(dǎo)急性白血病(AL)原代細(xì)胞凋亡的形態(tài)、生化特征，并分析量效關(guān)系，以指導(dǎo)臨床治療。方法經(jīng)HHar作用后的AL原代細(xì)胞由光鏡、電鏡觀察形態(tài)特征，DNA凝膠電泳、二苯胺法測(cè)定生化特征，SSPS軟件分析量效關(guān)系。結(jié)果HHar作用后AL原代細(xì)胞形態(tài)、生化特征均符合典型的細(xì)胞凋亡改變；其DNA片段化率隨HHar作用時(shí)間的延長(zhǎng)，濃度的增高而增加，具有時(shí)間效應(yīng)及劑量效應(yīng)線性趨勢(shì)。DN

2、A片段化率與壞死率正相關(guān)。結(jié)論HHar確可誘導(dǎo)AL原代細(xì)胞凋亡。其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力因劑量、作用時(shí)間的不同而不同。關(guān)鍵詞：高三尖杉酯堿；急性白血?。坏蛲鲋蟹诸愄?hào)：R73-361文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-7431(2000)05-0331-04OBSERVATION OF THE APOPTOSIS OF PRIMARY ACUTE LEUKEMIA CELLS INDUCECD BY HOMOHARRINGTONINUMLI Hao,XU Jian, MIN Jie, et al.(Shandong Medical University，Jinan 250012,China)Abstr

3、act：ObjectiveTo observe the characteristics of apoptosis of primary actue leukemia cells induced by homoharringtoninum(HHar).MethodsThe morphological changes were observed by microscope, SEM and TEM, the biochemical characteristics were observed by DNA agarose gel electrophoresis, internucleosomal D

4、NA fragmentation ratios. The time-dose-effect relationship was analyzed by SSPS software. ResultsThe morphological and biochemical characteristics of apoptosis of primary acute leukemia cells induced by HHar were in common with the typical changes. The DNA fragmentation ratios of the primary leukemi

5、a cells increased gradully with increasing time and increasing HHar dose showing a time-effect and dose-effect linear trend, and was positively correlated to the necrosis rates of the cells. ConclusionHHar can induce primary acute leukemia cells apoptosis. Its effect is various according to differen

6、t concentration and different time.Key words：Homoharringtoninum;Leukemia,acute;Apoptosis高三尖杉酯堿(HHar)是臨床常用的化療藥物之一，近年來隨著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的治療方法的認(rèn)可及應(yīng)用，人們提出小劑量HHar的作用是以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為主，為驗(yàn)證這一推測(cè)，作者選取成人AL原代細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察HHar作用后細(xì)胞形態(tài)、生化特征改變，并進(jìn)一步分析量效關(guān)系，為臨床具體用藥提供可靠的理論依據(jù)。材料與方法一、病例收集初診AL病人骨髓10例，按1986年天津會(huì)議標(biāo)準(zhǔn)分型。年齡1744歲，男性7例，女性3例。ALL-L2 4

7、例，AML-M2a 3例，AML-M3b 2例，AML-M5a 1例。外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)：1.0×109/L52.60×109/L，骨髓原+早(原+幼)占：70.4%92.5%。二、藥液配制取HHar臨床常用量5 mg、2.5 mg、0.5 mg，依公式1計(jì)算得相應(yīng)的近似最大血藥濃度為：1.0 mg/L、0.5 mg/L、0.1 mg/L。配制成相應(yīng)濃度藥液，-20 避光保存。三、培養(yǎng)體系制備抽取患者骨髓5 ml，加肝素0.3 ml抗凝(125 U/ml)，制成單個(gè)核細(xì)胞懸液后常規(guī)分離，用含10% 小牛血清RPMI 1640制成5×105/ml細(xì)胞懸液。分離后細(xì)胞成

8、活率為100%，原+早(原+幼)占95%以上。分別加入不同濃度藥物，使終濃度達(dá)到最大血藥濃度。以同一病人原代細(xì)胞不加藥組為對(duì)照組。置37、5 % CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。四、Giemsa染色、掃描電鏡、透射電鏡觀察HHar作用后AL原代細(xì)胞的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)改變2。五、DNA凝膠電泳觀察HHar作用后AL原代細(xì)胞的凋亡3。六、二苯胺法定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞DNA片段化率4。七、臺(tái)盼藍(lán)染色記數(shù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的壞死率2。八、統(tǒng)計(jì)處理采用SSPS軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果一、光鏡下HHar作用后AL原代細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化以HHar 0.1 mg/L作用6 h后，AML-M2a、ALL-

9、L2原代細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)改變?yōu)槔?見插頁第頁3A、3B)。部分細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞體積變小，核染色質(zhì)濃集成塊狀或斷裂，核膜完整或發(fā)生裂解，細(xì)胞膜保持完整或包繞核碎片及少量胞質(zhì)形成凋亡小體。未發(fā)生凋亡的細(xì)胞體積較大，形態(tài)規(guī)則，胞核呈圓形或稍有凹陷，染色質(zhì)細(xì)，可見12個(gè)核仁，胞質(zhì)量少，嗜堿性。同時(shí)可見少數(shù)細(xì)胞體積增大，染色質(zhì)腫脹疏松，發(fā)生壞死。二、掃描電鏡下HHar作用后AL原代細(xì)胞的形態(tài)改變以AML-M3b原代細(xì)胞為例，如1a所示，體外培養(yǎng)6 h的對(duì)照組細(xì)胞呈球形，表面分布有粗短、形態(tài)各異的微絨毛。而經(jīng)HHar 0.1 mg/L作用6 h后的細(xì)胞，如1b、所示，出現(xiàn)表面平滑化，微絨毛消失，繼而細(xì)胞表面

10、形成大小不等的泡狀隆起，細(xì)胞以出泡的方式開始形成凋亡小體。1掃描電鏡下實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組AML-M3b原代細(xì)胞的形態(tài)特征1a：體外培養(yǎng)6 h的對(duì)照組(×8000)1b：HHar0.1 mg/L作用6 h(×10000)三、透射電鏡下HHar后AL原代細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)以AML-M2a原代細(xì)胞及對(duì)照組為例，如2a所示，體外培養(yǎng)6 h的對(duì)照組細(xì)胞核質(zhì)比值大，核染色質(zhì)豐富，分布均勻，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有較多細(xì)胞器，線粒體形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整。經(jīng)HHar 0.1 mg/L作用6 h后的細(xì)胞，如2b、2c所示，體積縮小，核染色質(zhì)邊集呈新月狀，核膜完整或發(fā)生裂解，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜保持完整。胞質(zhì)內(nèi)線粒體體

11、積縮小，呈現(xiàn)固縮，空泡化等改變。2透射電鏡下實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組AML-M2a原代細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)2a、2b體外培養(yǎng)6 h的對(duì)照組(×8000)；2b、2c HHar 0.1 mg/L作用6 h(×25000 8000)四、HHar作用后AL原代細(xì)胞凋亡的電泳結(jié)果以HHar 1.0 mg/L、0.5 mg/L、0.1 mg/L作用6 h后AML-M2b原代細(xì)胞DNA凝膠電泳結(jié)果為例。均可見明顯DNA梯狀譜(DNA ladder)，即180200 bp及其整數(shù)倍數(shù)的DNA片段成梯狀排列。對(duì)照組未見明顯的DNA梯狀譜。五、HHar對(duì)AL原代細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡及殺傷的量效關(guān)系各實(shí)驗(yàn)組DNA片段

12、化率隨HHar濃度的增高，作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，24 h達(dá)到峰值，后緩慢下降，對(duì)照組DNA片段化率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增高。高、中、低劑量組DNA片段化率具有時(shí)間效應(yīng)線性趨勢(shì)(2值為37.18、32.54、24.84，P0.01)，672 h各實(shí)驗(yàn)組DNA片段化率具有劑量效應(yīng)線性趨勢(shì)(2值為6.80、18.97、21.51、18.47、6.25，P0.01)。各實(shí)驗(yàn)組壞死率隨HHar濃度的增高，作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。對(duì)照組壞死率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增高。高、中、低劑量組壞死率具有時(shí)間效應(yīng)性趨勢(shì)(2值為22.0913.57、8.85，P0.01)，2472 h各實(shí)驗(yàn)組壞死率具有劑量效應(yīng)線性趨

13、勢(shì)(2值為4.01、11.46、14.67，P0.01)。DNA片段化率與壞死率正相關(guān)(r=0.495，P0.01)(表1)。表1急性白血病原代細(xì)胞HHar作用后的DNA片段化率和壞死率(±s)時(shí)間 (h)實(shí)驗(yàn)組(血藥濃度)對(duì)照組1.0 mg/L0.5 mg/L0.1 mg/LDNA片段化率(%)625.90±3.91*18.93±8.22?14.46±8.747.43±1.801248.65±5.99*42.89±8.10*40.34±9.58*16.41±6.372458.15±7.38*5

14、0.30±7.47*45.50±4.554*21.10±7.794851.54±8.67*48.92±8.56*46.79±9.74*23.52±7.927249.30±14.56*46.59±14.84*44.11±15.48*27.15±7.50壞死率(%)63.20±1.483*1.60±0.891.00±0.010.60±0.551212.16±5.52*7.56±3.094*5.29±2.433.14

15、77;1.682420.29±4.82*15.29±5.62*9.43±4.896.29±2.934829.43±6.70*23.57±6.73*18.86±5.58*10.14±2.037243.29±3.30*36.29±4.19*26.57±4.928*13.43±4.04與對(duì)照組進(jìn)行顯著性分析?P0.05，*P0.01；與低劑量組進(jìn)行顯著性分析P0.05，P0.01；與中劑量組進(jìn)行顯著性分析P0.05，P0.01 討論近年來，人們逐漸認(rèn)識(shí)到細(xì)胞增殖與凋亡的平衡影響著腫

16、瘤的發(fā)生、發(fā)展。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的治療方法成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)5。在白血病治療過程中，HHar不僅是一種重要的常規(guī)化療藥物，而且被用于MDS；一般狀況較差，不適強(qiáng)烈化療的AL患者及MDR(微量殘留白血病)進(jìn)行小劑量化療。如1988年國內(nèi)曾報(bào)道：小劑量HHar(0.250.5 mg/d)治療成人AML的CR率為27.08%6。由于HHar誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的量效關(guān)系不明確，僅推測(cè)其為“大劑量殺傷，小劑量誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡”。本研究以AL原代細(xì)胞為研究對(duì)象，模擬人體內(nèi)用藥后的最大血藥濃度，采用多種目前國內(nèi)、國外公認(rèn)的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的經(jīng)典方法證實(shí)了HHar確可誘導(dǎo)AL原代細(xì)胞凋亡，其形態(tài)、生化特征均符合經(jīng)典的凋亡改

17、變。對(duì)二苯胺定量測(cè)定的細(xì)胞DNA片段化率及臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)的壞死率進(jìn)行分析，顯示量效關(guān)系為：HHar作用AL原代細(xì)胞后高劑量組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力大于低劑量組，殺傷能力也大于低劑量組：藥物作用細(xì)胞后發(fā)生凋亡的時(shí)間早于壞死的時(shí)間，在同一時(shí)間點(diǎn)，發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)多于發(fā)生壞死的細(xì)胞數(shù)。因此，在組建個(gè)體化化療方案時(shí)，不應(yīng)僅把篩選抑制細(xì)胞增殖敏感性較高的藥物作為標(biāo)準(zhǔn)，而應(yīng)考慮到其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性。藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的量效關(guān)系要具體藥物具體分析，并不是所有藥物均遵循“大劑量殺傷，小劑量誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡”。藥物的用量要依據(jù)其量效關(guān)系。臨床急性白血病化療中，對(duì)HHar的敏感性因個(gè)體而異。在實(shí)驗(yàn)中亦可觀察到：同一時(shí)間

18、點(diǎn)，藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的數(shù)目因樣本的不同而差異較大，但量效關(guān)系是一致的。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡敏感性的指標(biāo)及臨床療效間的關(guān)系，將在以后的分組研究及臨床觀察中得以證實(shí)。HHar主要作用于細(xì)胞周期中G1、S及G2期，屬于細(xì)胞周期特異性藥物。人類白血病細(xì)胞以G0/G1期細(xì)胞占大多數(shù)，S、G2-M期內(nèi)細(xì)胞比例很低7。在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)過程中未加入任何外源性細(xì)胞因子，故保持了原有的周期分布特點(diǎn)。因此，HHar作用的靶細(xì)胞數(shù)目不同以及不同細(xì)胞周期內(nèi)的細(xì)胞對(duì)損傷的修復(fù)能力不同，可能是影響其量效關(guān)系的原因之一。仍有待于從藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的內(nèi)在機(jī)制及分子調(diào)控等多方面進(jìn)行深層次探討。(本研究的實(shí)驗(yàn)室工作得到山東省醫(yī)科院基礎(chǔ)所免疫室張玲教授、王蕓副主任技師的協(xié)助和指導(dǎo)，特此致謝。)(本文編輯：馬積慶)作者簡(jiǎn)介：李顥，女，碩士，住院醫(yī)師。李顥（山東醫(yī)科大學(xué)研究生濟(jì)南 250012）徐?。ㄉ綎|省立醫(yī)院）閔捷（山東省立醫(yī)院）張福東（山東省立醫(yī)院）彭翠蘭（山東省立醫(yī)院）徐功立（山東省立醫(yī)院）參考文獻(xiàn)1張魯榕，孔憲濤，謝映華，等.白血病化療