熒光定量PCR引物設(shè)計原則

1、1. 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。最好位于編碼區(qū)5'端的 300-400bp 區(qū)域內(nèi)，可以用 DNAman,Alignment 軟件 看看結(jié)果。2. 2. 產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)（自由能小于mol）。3. 3.引物長度一般在 17-25 堿基之間 , 上下游引物不能相差太大。4. +C含量在40%60之間，45-55 %最佳。5. 5. 堿基要隨機分布，盡量均勻。6. 6. 引物自身不能有連續(xù) 4 個堿基的互補。7. 7.引物之間不能有連續(xù) 4個堿基的互補。8. 8.引物5'端可以修飾。9. '端不可修飾，而且要避開 AT,GC rich的區(qū)域，避開 T/C

2、,A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)（2-3個）。10. 10. 引物 3'端要避開密碼子的第 3位。11. 11. 引物整體設(shè)計自由能分布 5端大于 3'端，且 3端自由能最好小于 9KJ/mol 。12. 可用 oligo 6 軟件進行比對看結(jié)果的情況。13. 12. 做熒光定量產(chǎn)物長度 80-150bp 最好，最長是 300bp.14. 13.引物設(shè)計避免 DNA虧染，最好跨外顯子接頭區(qū)。15. 14.引物與非特異性擴增序列的同源性最好小于70%或者有 8個互補堿基同源。16. 15.查看有無假基因的存在。假基因就是無功能的DNA序列，與需要擴增的目的片段長度相似。17. 值在 58-62

3、度之間。18. 17. 引物設(shè)計的軟件 Primer 有專門針對熒光的。設(shè)計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。引物分析軟件將試圖通過使用每一引物設(shè) 計變化的預(yù)定值在這兩個目標間取得平衡。設(shè)計引用有一些需要注意的基本原理： 引物長度一般引物長度為1830堿基?？偟恼f來，決定引物退火溫度(Tm值)最重要的因素就是引物的長度。有以下公式可以用于粗略計算引物的退火溫度。在引物長度小于 20bp時：4(G+C)+2(A+T)-5°C在引物長度大于 20bp 時：C +C(%G-C)-500/length-5 C另外有許多軟件也可以對退火溫度進行計算，其計算原理會各有不同，因此

4、有時計算出的數(shù)值可能會有少量差距。為了優(yōu)化 PCR反應(yīng)，使用確保退火溫度不低于54 C的最短的引物可獲得最好的效率和特異性?？偟恼f來，每增加一個核苷酸引物特異性提高 4倍，這樣，大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長度為 1 8個核苷酸。引物長度的上限并不很重要，主要與反應(yīng)效率有關(guān)。由于熵的原因，弓I物越長，它退火結(jié)合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結(jié)合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小。 GC含量一般引物序列中G+C含量一般為40%60% 對引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物 5'端加適量的 A T或G C尾巴。 退火溫度退火溫度需要比解鏈溫度低 5 C,如果引物堿

5、基數(shù)較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使PCR勺特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當減低退火溫度，是DNA雙鏈結(jié)合。一對引物的退火溫度相差 4 C 6C不會影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的，可以在55C75C間變化。 避免擴增模板的二級結(jié)構(gòu)區(qū)域 選擇擴增片段時最好避開模板的二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計算機軟件可以預(yù)測估計目的片段的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能(G)小于 mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza- 2'-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。 與靶DNA的錯配當被擴增的靶DNA序列較大的

6、時候，一個引物就有可能與靶DNA勺多個地方結(jié)合，造成結(jié)果中有多個條帶出現(xiàn)。這個時候有必要先使用BLAST軟件進行檢測，網(wǎng)址：。選擇 Align two sequences (bl2seq) ，如下圖。BLAST的使用方法也十分簡單，如下圖所示將引物序列粘貼到1區(qū)，將靶DNA序列粘貼到2區(qū)，這兩者可以互換的，并且 BLAST會計算互補、反義鏈 等多種可能，所以不需要用戶注意兩條鏈是否都是有義鏈。 如果知道序列在數(shù)據(jù)庫中的 GI號也可以直接輸 入GI號，這樣就不用粘貼一大段的序列了。 最后在3處點擊Align就可以查看引物在靶 DNA中是否有多個同源位點了可是使用BLAST還是有其不方便的地方。因

7、為它一次只能比較兩條序列，那么一對引物就需要分開進行 比對。如果存在錯配，還需要自己計算由于錯配形成的片段長度有多大。在下一篇中將介紹一個軟件，可 以直接將靶DNA和引物輸入對產(chǎn)物片段進行預(yù)測。 引物末端引物3'端是延伸開始的地方，因此要防止錯配就從這里開始。3'端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C,因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。3'端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR(AS-PCR反應(yīng)中，引物3'端不能發(fā)生錯配。如擴增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第 3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。 引物的二級結(jié)構(gòu)引物自

8、身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。兩引物之間不應(yīng)該存在互補性，尤應(yīng)避免3'端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。 為了下一步操作而產(chǎn)生的不完全匹配5'端對擴增特異性影響不大，因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等 ;弓|入蛋白質(zhì)結(jié)合 DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。額外的堿基或多或少會影響擴增的效

9、率，還加大引物二聚體形成的幾率，但 是為了下一步的操作就要作出適當?shù)摹盃奚?。很多時候PCR只是初步克隆，之后我們還需要將目的片段亞克隆到各種載體上，那么就需要在PCR這個步驟為下一步的操作設(shè)計額外的堿基。以下總結(jié)一些為了亞克隆所要設(shè)計的序列。a 添加限制性內(nèi)切酶酶切位點添加酶切位點是將 PCR產(chǎn)物進行亞克隆使用得最多的手段。一般酶切位點是六個堿基，另外在酶切位點的5'端還需要加23個保護堿基。但是不同的酶需要的保護堿基數(shù)目是不相同的，例如：Sal I不需要保護堿基，EcoRV需要1個，Not I需要2個，Hind山3個。其中，在原核表達設(shè)計引物時還有一些小技 巧，大家可以參考：原核表

10、達之實驗前的分析。里面一些規(guī)則是所有表達都通用的。有一種做法是在進行 PCR反應(yīng)的同時進行酶切，這樣就需要注意一些內(nèi)切酶在PCR反應(yīng)中的酶切反應(yīng)率，見附錄。不過這種方法雖然方便但并不推薦。有時候，就是把PCR產(chǎn)物回收后酶切再與載體連接效果都不盡理想，同步進行會使出現(xiàn)問題的原因變得更加復(fù)雜。一旦出現(xiàn)問題，分析起來更麻煩。b LIC 添加尾巴LIC的全稱是Ligation-Independent cloning ，它是Navogen公司專門為其部分的 pET載體而發(fā)明的一 種克隆方法。用LIC法制備的pET載體有不互補的12 - 15堿基單鏈粘端，與目的插入片段上相應(yīng)粘端互 補。擴增目的插入片段的

11、引物 5'序列要與LIC載體互補。T4 DNA聚合酶的3' -5'外切活性經(jīng)短時間即可 在插入片段上形成單鏈粘端。由于只能由制備好的插入片段和載體互相退火形成產(chǎn)物，這種方法非?？焖?高效，而且為定向克隆。c定向TA克隆添加尾巴在T載體剛出的時候大家都拍手稱贊，真是方便，哪個小子腦子這么聰明想出來的。但是后來人們發(fā)現(xiàn)TA克隆無法將片段定向克隆到載體中，所以后來Invitrogen 推出了可以定向克隆的載體，它的一端含有四個突出的堿基GTGG因此在PCR引物設(shè)計時也要相應(yīng)的加上與之互補的序列，這樣片段就可以“有方向”了。d In-Fusion 克隆方法這項技術(shù)是Clontech還屬于BD的時候推出的。此技術(shù)就其步驟來說是及其方便的，不需連接酶，不需 長時間的反應(yīng)。只要在設(shè)計引物的時候引入一段線性化載體兩端的序列，然后將PCRT物和線性化的載體加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室溫下放置半個小時就可以進行轉(zhuǎn)化了。這種方法特別適合大 批量的轉(zhuǎn)化。如果要加入額外的堿基總是或