實驗技術膠體金

1、實驗一：TEM包埋塊的制備一、實驗目的學習掌握常規(guī)生物樣品前處理技術及樣品包埋塊的制備技術。二、實驗材料小鼠肝臟細胞三、實驗試劑2.5戊二醛、PBS、1鋨酸、30丙酮、100丙酮、Epon812包埋液、蠟油四、實驗器材離心管、玻璃棒、滴管、移液槍、刀片、鑷子、牙簽、烘箱、切片機五、溶液配置1、磷酸緩沖液（Phosphate Buffer Saline, PBS）0.2molL-1 PBS 配制A液：Na2HPO4 .2H2O 35.61g 加DDW 至 1000mlB液：NaH2PO4 .H2O 27.6g 加DDW 至 1000ml2、不同pH磷酸緩沖液的配制pH 6.6 6.8 7.0 7

2、.2 7.4 7.6A液 (ml)18.8 24.5 30.5 36.0 40.5 43.5B液 (ml)31.2 25.5 19.5 14.0 9.5 6.53、Epon812包埋液的配制 Epon812樹脂 20ml DDSA 4.6ml MNA 15.3ml DMP-30 0.8ml六、實驗步驟1、切取1mm3左右大小的組織塊，立即放入PBS（pH7.2)配制的2.5%戊二醛中固定10-15分鐘。2、用0.1molPBS緩沖液沖洗三次（每次35分鐘）。3、1鋨酸固定30分鐘，然后用緩沖液沖洗三次（每次35分鐘）。4、丙酮脫水：3050708090100100，每級35分鐘5、浸透與包埋：

3、 脫水劑：包埋劑=1：2，過夜6、第二天任意時間進行包7、標簽用硫酸紙內8、聚合：45 12h 60 24h樣品標簽學號 七、注意事項1、取材的時候動作要迅速，組織離體后應將其快速放入固定液中。并且要盡量減少損傷，減少牽拉或擠壓組織。組織塊的大小一般為1mm3。2、用固定液固定的樣品若漂浮在溶液表面，應通過抽真空的方法讓樣品沉入溶液中。3、餓酸為劇毒、極易揮發(fā)的試劑，使用時要注意安全。4、脫水時要逐級脫水，而不能急劇脫水，更換液體時動作要快，不要讓組織離開溶液，否則會在組織內外產生氣泡。5、在制備支持膜的時候手一定要穩(wěn)，不能抖動，這樣制出的膜才會厚薄均一。在將載玻片浸水的時候要緩慢入水，這樣才

4、會使膜利用水的張力慢慢的離開載玻片，漂浮在水面上。實驗二、支持膜和膠體金的制備一、實驗原理氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金顆粒由一個基礎金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構成，緊連在金核表面的是內層負離子（AuC12），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。膠體金標記，實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也

5、就是不同顏色的膠體金顆粒。免疫金標記技術(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。檸檬酸三鈉法0.01%氯金酸（HAuCl4)水溶液100ml加熱至沸騰，加4ml 1%檸檬酸三鈉水溶液，出現酒紅色。金顆粒大小與檸檬酸三鈉的關系檸檬酸三鈉（ml) 4 1.5 1.0 0.75金顆粒的直徑（nm) 15 30 50 60二、實驗步驟1

6、、膠體金pH的調節(jié)：用0.1mol K2CO3調到pH9.02、取7支2ml離心管分別加入1ml膠體金3、再向每支管中加入1ml不同濃度的牛血清白蛋白4、混合均勻后分別加入0.1ml10%NaCl膠體金與標記蛋白的配比：蛋白含量ug（牛血清白蛋白）5、混合均勻后按照下圖觀察顏色的變化6、確定出包裹膠體金蛋白的量三、注意事項1、配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。2、氯金酸的質量要求上乘，雜質少。最好是進口的。3、玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得

7、預期大小的金顆粒。實驗三、制片及超薄切片演示TEM、SEM觀察一、實驗目的1、掌握透射電子顯微鏡的成像基本原理及其應用2、掌握掃描電子顯微鏡的成像基本原理及其應用二、實驗原理1、透射電子顯微鏡的成像基本原理在真空條件下，電子束經高壓加速后，穿透樣品時形成散射電子和透射電子，它們在電磁透鏡的作用下在熒光屏上成像。2、掃描電子顯微鏡的成像基本原理利用二次電子信號成像來觀察樣品的表面形態(tài)。電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成像。三、主要電鏡制樣技術1、超薄切片技術 用于電鏡觀察的樣本制備2、負染色技術 染色背景，襯托出樣品的精細結構3、冰凍蝕刻技術 冰凍斷裂與蝕刻復型：主

8、要用來觀察膜斷裂面的蛋白質顆粒和膜表面結構。4、電鏡三維重構技術電子顯微術、電子衍射與計算機圖象處理相結合而形成的具有重要應用前景的一門新技術。電鏡三維重構技術與X-射線晶體衍射技術及核磁共振分析技術相結合，是當前結構生物學（主要研究生物大分子空間結構及其相互關系）的主要實驗手段。四、實驗步驟1、制刀：刀的種類：玻璃刀，鉆石刀2、玻璃刀的制作:玻璃要求:硬,含硅高（7275%),h=48mm，寬25mm、38mm，長30cm；步驟：洗滌玻璃條，并晾干；制成小方塊，對角折斷；檢查刀刃； 檢查的標準：中左端平直無缺損；右端稍上翹；顯微鏡下刀刃有明亮的應力線。 制刀的手段：手工制刀、專用制刀機制刀。觀察上面有圖可以發(fā)現連續(xù)的切片3、裝水槽方法： 裝塑料模具水槽； 自制膠帶水槽槽液的要求： 不與材料發(fā)生化學反應； 干凈無雜質； 液面與刀口基本平行； 低粘度,蒸發(fā)量小； 有一定的表面張力,有利于漂浮切片常用的槽液：雙蒸水、二甲基亞砜（DMSO）、甘油水溶液等。4、修塊 除去組織周圍多余的包埋介質和不感興趣的部分，以提供較大的有效觀察面積。 含組織塊的區(qū)域和不含組織塊的區(qū)