一種高效擴增人T細(xì)胞受體β鏈可變區(qū)基因的方法建立

1、一種高效擴增人T細(xì)胞受體鏈可變區(qū)基因的方法建立         11-01-28 13:42:00     編輯：studa20          作者：葉海燕, 王琳, 范振平 鐘彥偉 蘇何玲 劉永明, 徐東平【摘要】  目的: 建立一種高效擴增人T細(xì)胞受體（TCR）鏈可變區(qū)（V）基因的方法。方法: 根據(jù)TCR V26個亞家族基因序列特點設(shè)計擴增V基因的上游內(nèi)引物34條、 上

2、游外引物37條, 并將內(nèi)、 外上游引物各分為8個簡并組。在恒定區(qū)（C區(qū)）設(shè)計下游內(nèi)、 外和測序引物各1條以及擴增C基因的上游引物1條。提取細(xì)胞RNA, 用PolyA介導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄后, 采用巢式PCR擴增正常人CD8 T細(xì)胞TCR V26個亞家族基因, 并用Jurkat T淋巴瘤細(xì)胞作為對照。用Teasy載體克隆RTPCR 產(chǎn)物, 對克隆基因進(jìn)行測序。結(jié)果: 從正常人的CD8 T細(xì)胞中擴增到所有TCR V亞家族基因, 克隆后測序與相應(yīng)的參考序列同源。從Jurkat細(xì)胞擴增出TCR V8基因, 經(jīng)測序驗證與文獻(xiàn)報道一致, 且最少可從10個細(xì)胞提取的RNA模板中擴增成功。結(jié)論: 建立的巢式RTPCR方法

3、可以高效、 廣譜地擴增人TCR V基因, 為進(jìn)一步進(jìn)行抗原特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的TCR克隆和功能研究打下了良好基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  CD8 T細(xì)胞; T細(xì)胞受體（TCR）; 反轉(zhuǎn)錄PCR; 基因克隆    Abstract  AIM:   To develop an effective assay for amplifying human Tcell receptor (TCR) variable region of chain (V)encoding genes.  METHODS:   B

4、ased on the property of the 26 subfamilies of human TCR Vencoding gene sequence,  34 sets of outer and 37 sets of inner sense primers were divided into 8 degenerate primer groups,  and a set of outer and inner antisense primers located in conserved region chain (C) was designed for the amp

5、lification of the TCR Vencoding genes. In addition,  a sequencing primer and a sense primer for amplifying Cencoding genes were designed. CD8 Tcell RNA was extracted and subjected to reverse transcription mediated by poly A,  followed by a nested polymerase chain reaction (PCR) to amplify

6、the 26 subfamilies of human TCR Vencoding genes. Jurkat T lymphoma cells were used as control. Teasy vector was employed to detect DNA sequencing of the cloned target genes.  RESULTS:   All the subfamilies of the Vencoding genes were obtained from CD8 T cells of a healthy donor, 

7、 except the subfamily of V8 , was obtained from Jurkat cells. The results were confirmed by DNA sequencing of the cloned genes.  CONCLUSION:   The nested RTPCR assay can effectively amplify human TCR Vencoding genes with broad spectrum,  which is helpful for the cloning and funct

8、ional study of the TCR expressed by antigenspecific cytotoxic T lymphocytes.    KeywordsCD8 T cell;  Tcell receptor (TCR);  RTPCR;  gene cloningT細(xì)胞受體（Tcell receptor,  TCR）是T細(xì)胞表面特異性識別抗原和介導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子, 可分為TCR/和TCR/兩種類型, 外周血T細(xì)胞主要為TCR/的T細(xì)胞, 是介導(dǎo)機體特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞。TCR基因由可變區(qū)（V）

9、、 多變區(qū)(D)、 結(jié)合區(qū)（J）和恒定區(qū)（C）四部分基因片段組成。在T細(xì)胞發(fā)育過程中V區(qū)、 D區(qū)和J 區(qū)進(jìn)行重排而形成具有功能的TCR編碼基因, 重排的過程中VD和DJ 之間可有不同數(shù)量的核苷酸隨機插入或刪減的現(xiàn)象, 這種基因片段連接的不準(zhǔn)確性使TCR的表達(dá)呈多樣性, 以識別各種不同的抗原1。因此, 分析TCR V亞家族的表達(dá)和利用情況, 對闡明腫瘤、 自身免疫性疾病以及病毒感染等疾病的致病機制十分重要2-4。然而由于TCR V的多樣性, 采用已往報道用的RTPCR方法在T細(xì)胞數(shù)量很少以及TCR表達(dá)很微量的情況下擴增TCR基因靈敏度不高或代表性不夠。本研究通過優(yōu)化引物設(shè)計和應(yīng)用巢式RTPCR使

10、TCR V的擴增具有很高的靈敏度和廣泛的代表性。PCR產(chǎn)物進(jìn)一步做DNA克隆, 挑取單克隆菌落測序, 了解TCR V鏈的表達(dá)和分布情況, 為進(jìn)一步研究病毒感染時特異性T細(xì)胞TCR的偏性取用（bias usage）和克隆性增殖的情況提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。    1  材料和方法    1.1   材料  用于分選CD8 T細(xì)胞的外周血單個核細(xì)胞（PBMC）來自1例男性健康成年人, Jurkat 淋巴瘤細(xì)胞為本室保存, MACS（Magnetic activated cell sorter）磁珠分選CD

11、8 T細(xì)胞的試劑與分離柱和分離器購自德國Miltenyi Biotec公司, 熒光標(biāo)記的抗CD3和抗CD8抗體購自美國BDPharmingen公司, 提取細(xì)胞RNA的RNessy mini盒、 PCR產(chǎn)物回收和凝膠電泳產(chǎn)物回收試劑盒均購自德國Qiagen公司, 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pGEM Teasy 載體均購自美國Promega公司。    1.2  方法    1.2.1  PBMC分離和CD8 T細(xì)胞分選  按照常規(guī)方法分離PBMC, CD8 T細(xì)胞的MACS磁珠分選操作方法按說明書進(jìn)行。分選后的CD8

12、T細(xì)胞用熒光標(biāo)記的抗CD3和抗CD8抗體染色、 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測CD8 T細(xì)胞的純度和數(shù)量, 用RPMI1640液調(diào)整細(xì)胞密度至 2×109/L備用。    1.2.2  引物  根據(jù)文獻(xiàn)資料5,  6和從GenBank下載的257條人TCR V基因序列進(jìn)行分析, 根據(jù)V各個亞家族的基因序列特點, 在相對保守的信號肽區(qū)設(shè)計出相應(yīng)的25個亞家族特異性上游引物(V26亞家族基因為假基因, 故不設(shè)計實驗), 因為有些TCR V亞家族內(nèi)部還分為幾個不同的分家族, 故共設(shè)計了上游外引物34條和上游內(nèi)引物37條; 在C區(qū)設(shè)計下游

13、外引物down1、 下游內(nèi)引物down2、 測序引物down3各1條, 以及擴增C基因的上游引物C1（表1）。引物由上海生工公司合成。表1  擴增TCR V和C編碼基因的引物設(shè)計    1.2.3  RNA提取和巢式RTPCR反應(yīng)  CD8 T細(xì)胞或Jurkat細(xì)胞RNA的提取按照文獻(xiàn)7的方法進(jìn)行。應(yīng)用(oligo)dT引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈, 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為40 1 h。以cDNA為第1輪PCR反應(yīng)模板, 將上游外引物分為8組簡并引物分別與down1進(jìn)行8個PCR反應(yīng), PCR擴增總體積為25 L/管, 反應(yīng)條件為94 5

14、min; 94 30 s,  59 30 s（每個循環(huán)遞減1）, 55 30 s, 72 1 min, 30個循環(huán);  72  5 min; 68 5 min。第2輪PCR反應(yīng)以第1輪PCR產(chǎn)物為模板, 將對應(yīng)的8組簡并上游內(nèi)引物分別與down2加入各反應(yīng)管中, 反應(yīng)體積為50 L/管, 反應(yīng)條件為94 3 min; 94 30 s, 60 1 min, 72 1 min, 40個循環(huán); 72 5 min; 68 5 min; Jurkat細(xì)胞RNA模板擴增基因片段長度為578 bp。一些實驗中, 第2輪PCR反應(yīng)使用單一上游引物分管反應(yīng), 以確定各亞家族引物的擴

15、增效率。同時擴增actin和TCR C編碼基因做為質(zhì)控對照。RTPCR反應(yīng)擴增TCR鏈編碼基因的步驟示意見圖1。    1.2.4  DNA克隆  PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠（溴乙錠染色）中進(jìn)行電泳分析, 挑取V14亞家族基因的PCR產(chǎn)物做DNA克隆, 切取目的基因片段, 回收PCR產(chǎn)物, 與pGEM Teasy 載體連接。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌JM109, 氨芐青霉素和Xgal 藍(lán)白斑法篩選陽性菌落, 挑取15個單克隆白色菌落于10 L H2O中 94加熱10 min以裂解菌體后, 按第2輪PCR體系進(jìn)行PCR反應(yīng), PCR經(jīng)電泳鑒定后提

16、取重組質(zhì)粒進(jìn)行測序, 測序引物為down3。    1.2.5  序列對比  根據(jù)文獻(xiàn)報道的標(biāo)準(zhǔn)序列號, 應(yīng)用Vector NTI 軟件的AlignX組件以及Virusblast軟件, 將本實驗所測的TCRV編碼基因序列與已知各種TCR V編碼基因參考序列進(jìn)行比對。    2  結(jié)果    2.1  RTPCR擴增TCR鏈編碼基因  經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和用8組簡并上游引物和下游引物介導(dǎo)二輪PCR擴增后, Jurkat細(xì)胞樣本只有在含V8亞家族引物的4B組擴增到了目的條帶, 測序結(jié)果與文獻(xiàn)報導(dǎo)一致, 為V8; CD8 T細(xì)胞在分選后純度為95.9%, 樣本在8組中均擴增出目的條帶（圖2B）; 用各種單一引物進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)時所有亞家族引物均可獲得擴增條帶, 圖2B顯示了以第1組上游簡并引物介導(dǎo)的第1輪PCR產(chǎn)物為模板, 第2輪中采用同組5種單一上游引物擴增的結(jié)果。actin和C編碼基因經(jīng)一輪PCR擴增即可獲得目的條帶（圖片未顯示）。圖2A顯示用含V8亞家