第五酶和細(xì)胞固定化

1、Chapter 5 Immobilized Enzyme and Cell固定化酶和細(xì)胞固定化酶和細(xì)胞制作：鄭穗平酶應(yīng)用過(guò)程中的一些不足酶應(yīng)用過(guò)程中的一些不足l 酶的穩(wěn)定性較差酶的穩(wěn)定性較差：除了某些耐高溫的酶，如-淀粉酶、Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受較低的pH條件以外，大多數(shù)的酶在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活。 l 酶的一次性使用酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中與底物反應(yīng)，這樣酶在反應(yīng)系統(tǒng)中，與底物和產(chǎn)物混在一起，反應(yīng)結(jié)束后，即使酶仍有很高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使生產(chǎn)成本提高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)。 l 產(chǎn)物的分離純化較困難產(chǎn)

2、物的分離純化較困難：酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起，無(wú)疑給產(chǎn)物的進(jìn)一步的分離純化帶來(lái)一定的困難。 固定化技術(shù)固定化技術(shù)Contents of chapter 51、什么是固定化技術(shù)和固定化酶2、固定化酶的研究歷史3、酶的固定化技術(shù)4、固定化酶的特點(diǎn)GoGoGoGo6、細(xì)胞、原生質(zhì)體的固定化，自學(xué)5、固定化酶的應(yīng)用Go5.1 5.1 什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性載體水不溶性載體水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技術(shù)固定化技術(shù)化學(xué)偶聯(lián)酶酶固定化固定化間歇間歇可溶可溶交聯(lián)包埋吸附間歇間歇連續(xù)連續(xù)酶的固定化技術(shù)和固定化酶固定化酶：經(jīng)提取和分離純化后的酶 固定

3、化菌體(死細(xì)胞)：含酶菌體或菌體碎片 固定化細(xì)胞：在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞 l 優(yōu)點(diǎn)：1.不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；2.可反復(fù)使用；3.可連續(xù)化生產(chǎn)；4.穩(wěn)定性好。l 缺點(diǎn)：固定化過(guò)程中往往會(huì)引起酶的失活本章目錄l 固定化酶的研究從50年代開(kāi)始，1953年德國(guó)的 Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯樹(shù)脂聚氨基苯乙烯樹(shù)脂為載體與羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等結(jié)合，制成固定化酶。l 60年代后期，固定化技術(shù)迅速發(fā)展起來(lái)。1969年，日本的千煙一郎首次在工業(yè)上生產(chǎn)應(yīng)用固定化氨基?；笍墓潭ɑ被；笍腄L-DL-氨基酸連續(xù)生產(chǎn)氨基酸連續(xù)生產(chǎn)L-L-氨基氨基酸酸，

4、實(shí)現(xiàn)了酶應(yīng)用史上的一大變革。l 在1971年召開(kāi)的第一次國(guó)際酶工程學(xué)術(shù)會(huì)議上，確定固定化酶的統(tǒng)一英文名稱為Immobilized enzymeImmobilized enzyme。5.2 固定化酶的研究歷史l 隨著固定化技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)固定化菌體固定化菌體 。1973年，日本首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化大腸桿菌菌體中的天門冬氨酸酶，由反丁烯二酸固定化大腸桿菌菌體中的天門冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)連續(xù)生產(chǎn)L-L-天門冬氨酸天門冬氨酸。l 在固定化酶和固定化菌體的基礎(chǔ)上，70年代后期出現(xiàn)了固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞技術(shù)。 1976年，法國(guó)首次用固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草桿菌生

5、產(chǎn)淀粉酶，開(kāi)始了用固定化細(xì)胞生產(chǎn)酶的先例。l 1982年，日本首次研究用固定化原生質(zhì)體固定化原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸，取得進(jìn)展。固定化原生質(zhì)體由于解除了細(xì)胞壁的障礙，更有利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌，這為胞內(nèi)酶生產(chǎn)技術(shù)路線的變革提供了新的方向。本章目錄5.3 5.3 酶固定化技術(shù)酶固定化技術(shù)l 活性中心活性中心：保護(hù)酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基團(tuán)固有的高級(jí)結(jié)構(gòu)不受到損害，在制備固定化酶時(shí)，需要在非常嚴(yán)密的條件下進(jìn)行。l 功能基團(tuán)功能基團(tuán)：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等，當(dāng)這些功能基團(tuán)位于酶的活性中心時(shí)，要求不參與酶的固定化結(jié)合l 酶的高級(jí)結(jié)

6、構(gòu)酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)：要避免用高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等處理，而且有機(jī)溶劑、高濃度的鹽也會(huì)使酶變性、失活，因此，操作應(yīng)盡量在非常溫和的條件下進(jìn)行。固定化酶操作的注意事項(xiàng)固定化酶操作的注意事項(xiàng)1 1、吸附法、吸附法 利用各種固體吸附劑將酶或含酶利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法的方法。 常用的固體吸附劑有活性炭、氧活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石硅膠、羥基磷灰石等。 操作簡(jiǎn)便，條件溫和，不會(huì)引起酶變性失活，載體廉價(jià)易得，而且可反復(fù)使用。 由于靠物理吸附作用，結(jié)合力較結(jié)合力較弱弱，酶與載

7、體結(jié)合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。 2 2、包埋法包埋法 將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法固定化的方法。 包埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹(shù)脂、聚酰胺、火棉膠等。根據(jù)載體材料和方法的不同，可分為：凝膠包埋法凝膠包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中，制成一定形狀的固定化酶或固定化含酶菌體。大多數(shù)為球狀或片狀，也可按需要制成其他形狀。常用的凝膠有瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺凝膠、光交聯(lián)樹(shù)脂等合成凝膠。 半透膜包埋法半透膜包埋法

8、：將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。常用于制備固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉膠膜等 首先被采用包埋法的是： 固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉雙丙烯酰胺，丙烯酰胺，引發(fā)劑海藻酸鈣海藻酸鈣包埋法裝置包埋法裝置將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，并把酶或細(xì)胞分散在其中，然后將其滴入凝固浴中（常用CaCl2 溶液），使海藻酸鈉中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多價(jià)離子交聯(lián)的離子網(wǎng)絡(luò)凝膠。顆粒大小可實(shí)時(shí)監(jiān)控顆粒大小可實(shí)時(shí)監(jiān)控脂質(zhì)體包裹脂質(zhì)體包裹3、結(jié)合法、結(jié)合法 選擇適宜的載體，使之通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起選擇適宜的載體，使之通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵

9、與酶結(jié)合在一起的固定化方法。的固定化方法。根據(jù)酶與載體結(jié)合的化學(xué)鍵不同，可分為：離子鍵結(jié)合法離子鍵結(jié)合法：通過(guò)離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為離子鍵結(jié)合法。離子鍵結(jié)合法所使用的載體是某些不溶于水的離子交換劑。常用的有DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等。 共價(jià)鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法：通過(guò)共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為共價(jià)鍵結(jié)合法。共價(jià)鍵結(jié)合法所采用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)主要有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。要使載體與酶形成共價(jià)鍵，必須首先使載體活化載體活化，第一

10、個(gè)離子結(jié)合法固定化酶：第一個(gè)離子結(jié)合法固定化酶：DEAE-CelluloseDEAE-Cellulose固定化過(guò)氧化氫酶固定化過(guò)氧化氫酶第一個(gè)工業(yè)化的固定化酶：第一個(gè)工業(yè)化的固定化酶：DEAE-SephadexDEAE-Sephadex A-50 A-50固定化氨基?；腹潭ɑ被；? 4、交聯(lián)法、交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。戊二醛有兩個(gè)醛基，這兩個(gè)醛基都可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng)，形成席夫（Schiff）堿，而使酶或菌體蛋白交聯(lián)，制成固定化酶或固定化菌體。交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結(jié)合牢固結(jié)合牢固，可以長(zhǎng)時(shí)間使用。但由于交聯(lián)反應(yīng)條件

11、較激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，致使酶酶活力損失較大活力損失較大，而且制備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小顆粒較小，給使用帶來(lái)不便。為此，可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，以取長(zhǎng)補(bǔ)短以取長(zhǎng)補(bǔ)短。 常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應(yīng)用最廣泛的是戊二醛。酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián) 酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶本章目錄5.4 5.4 固定化酶的特性：固定化酶的特性：l 將酶或含酶菌體固定化制成固定化酶或固定

12、化菌體以后，由于受到載體等的影響，酶的特性可能會(huì)有些變化。 l 固定化酶的穩(wěn)定性一般比游離酶的穩(wěn)定性好。 l 固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，活化能也變化不大。 l 酶經(jīng)過(guò)固定化后，其作用的最適pH值往往會(huì)發(fā)生一些變化。這一點(diǎn)在使用固定化酶時(shí)，必須引起注意。影響固定化酶最適pH值的因素主要有兩個(gè)，一個(gè)是載體的帶電性質(zhì)，另一個(gè)是酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì)。l 固定化酶的底物特異性與游離酶比較可能有些不同，其變化與底物分子量的大小有一定關(guān)系。固定化酶底物特異性的改變，是由于載體的空間位阻作用引起的。 本章目錄乙酰乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酸乙酰乙酰 -D AlaAminoacy

13、lase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶5.5 5.5 固定化酶的應(yīng)用固定化酶的應(yīng)用世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶。世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶。1969年，日本田邊制藥公司將從米曲霉中提取分離得到的氨基?；?，用DEAE-葡聚糖凝膠為載體通過(guò)離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，將L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用來(lái)拆分DL-乙酰氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸經(jīng)過(guò)消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再進(jìn)行拆分。生產(chǎn)成本僅為用游離酶生產(chǎn)成本的60左右。 泵泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)離心機(jī)消消旋旋反反應(yīng)應(yīng)器器固定化酶柱子晶體 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala高果

14、糖漿的生產(chǎn)高果糖漿的生產(chǎn)淀粉液化液淀粉酶糖化酶糖化液噴霧干燥氫化還原結(jié)晶異構(gòu)酶粉狀葡萄糖山梨醇結(jié)晶葡萄糖果葡糖漿果糖42%葡萄糖55%低聚糖分離混合高果糖漿果糖漿果糖80-90%果糖55%葡萄糖39%低聚糖世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖異構(gòu)酶的放線菌細(xì)胞用6065熱處理15min，該酶就固定在菌體上，制成固定化酶，催化葡萄糖異構(gòu)化生成果糖，用于連續(xù)生產(chǎn)果葡糖漿。 青霉素?；皋D(zhuǎn)化流程圖青霉素?；皋D(zhuǎn)化流程圖酶?jìng)鞲衅髅競(jìng)鞲衅鱨 酶?jìng)鞲衅魇怯晒潭ɑ概c傳感元件兩部分組成的，其中酶是與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合形成的不溶于水的固定化酶膜。l 最常用的酶?jìng)鞲衅魇敲鸽姌O酶電極，即將

15、固定化酶膜與轉(zhuǎn)換電極做在一起，當(dāng)酶膜與被測(cè)物發(fā)生催化反應(yīng)而生成電極活性物質(zhì)后，電極測(cè)定活性物質(zhì)并將其轉(zhuǎn)換為電信號(hào)輸出。酶電極酶電極l 酶電極是由固定化酶與各種電極密切結(jié)合的傳感裝置。1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出酶電極并把它用于葡萄糖的定量分析。l 酶電極一般可根據(jù)電極檢測(cè)物理量的不同分為電流型和電壓型，前者一般有氧電極、H2O2電極等，后者有NH3、CO2、H2電極等。l 較典型的一種酶電極為葡萄糖酶電極葡萄糖酶電極。葡萄糖醌H2O葡萄糖酸氫醌葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶氫醌 醌2H2ePt鉑電極葡萄糖酶電極結(jié)構(gòu)示意圖 l葡萄糖酶電極的敏感

16、膜是葡萄糖氧化葡萄糖酶電極的敏感膜是葡萄糖氧化酶（酶（GOD），它被固定在聚乙烯酰胺凝），它被固定在聚乙烯酰胺凝膠上。在酶膜的作用下葡萄糖發(fā)生氧化膠上。在酶膜的作用下葡萄糖發(fā)生氧化反應(yīng)，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和過(guò)氧反應(yīng)，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫。通過(guò)用電極測(cè)量被消耗的氧或生化氫。通過(guò)用電極測(cè)量被消耗的氧或生成的過(guò)氧化氫就可了解葡萄糖濃度。成的過(guò)氧化氫就可了解葡萄糖濃度。 手掌型葡萄糖手掌型葡萄糖(glucose)(glucose)分析儀分析儀脲電極Urea + 2H2O 2NH4+2HCO3-脲酶產(chǎn)生的2NH4+為陽(yáng)離子電極感應(yīng)。此外還有：氨基酸電極醇電極尿酸電極乳酸電極青霉素電極亞硝酸離子電極：菠菜亞硝酸還原酶產(chǎn)生NH3一些常見(jiàn)的酶電極一些常見(jiàn)的酶電極底 物酶電 極5腺苷酸5腺苷酸脫氨酶NH4+乙醇，醇乙醇脫氫