分子熒光分析法1(1)

1、熒光及熒光分析熒光及熒光分析 熒光及熒光分析熒光及熒光分析n概述概述n基本原理基本原理n熒光分析熒光分析n儀器與技術(shù)儀器與技術(shù)n應(yīng)用與示例應(yīng)用與示例光學(xué)光譜區(qū)光學(xué)光譜區(qū)遠(yuǎn)紫外遠(yuǎn)紫外近紫外近紫外 可見光可見光 近紅外近紅外中紅外中紅外 遠(yuǎn)紅外遠(yuǎn)紅外（真空紫外）（真空紫外）10nm200nm200nm 380nm380nm 780nm780 nm 2.5 m2.5 m 50 m50 m 300 m 什么是熒光什么是熒光 ？ 熒光基礎(chǔ)理論熒光基礎(chǔ)理論當(dāng)當(dāng)紫外或可見光紫外或可見光照射到照射到某些某些物質(zhì)上時(shí)，這物質(zhì)上時(shí)，這些物質(zhì)就會(huì)些物質(zhì)就會(huì)發(fā)射發(fā)射出波長(zhǎng)和強(qiáng)度各不相同的出波長(zhǎng)和強(qiáng)度各不相同的光線，停

2、止照射光照射時(shí)，這種光線光線，停止照射光照射時(shí)，這種光線馬上馬上或逐漸或逐漸消失，這就是熒光消失，這就是熒光。熒光的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展熒光的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展l 1575年年，西班牙醫(yī)生，西班牙醫(yī)生N. MonardesN. Monardes首先發(fā)現(xiàn)熒光首先發(fā)現(xiàn)熒光l 1852年，年，StokesStokes發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)熒光波長(zhǎng)比照射光波長(zhǎng)熒光波長(zhǎng)比照射光波長(zhǎng) 要長(zhǎng)要長(zhǎng)，認(rèn)定熒光是發(fā)射光。，認(rèn)定熒光是發(fā)射光。l 1867年，年，首次用于分析測(cè)定。首次用于分析測(cè)定。l 1952年，年，商品熒光分光光度計(jì)出現(xiàn)。商品熒光分光光度計(jì)出現(xiàn)。l 2008年，年，日本村修、美國(guó)馬丁日本村修、美國(guó)馬丁沙爾菲、沙爾菲、美籍美籍 華

3、裔錢永健華裔錢永健因發(fā)現(xiàn)并發(fā)展了因發(fā)現(xiàn)并發(fā)展了綠色熒光蛋白質(zhì)綠色熒光蛋白質(zhì)技技 術(shù)而獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。術(shù)而獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 分子發(fā)光：處于基態(tài)的分子吸收能量（電、熱、化學(xué)和光能等）被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)并發(fā)射出光子，此種現(xiàn)象稱為發(fā)光。發(fā)光分析包括熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光等。 物質(zhì)吸收光能后所產(chǎn)生的光輻射稱之為熒光和磷光。熒光產(chǎn)生的基本原理熒光產(chǎn)生的基本原理分子發(fā)光的類型分子發(fā)光的類型可以按兩種不同的辦法加以分類,其中一種以激發(fā)的模式加以分類,另一種是按分子激發(fā)態(tài)的類型來分類. 按分子激發(fā)態(tài)的類型可分為熒光和磷光,熒光:由第一電子激發(fā)單重態(tài)所產(chǎn)生的輻射躍遷而伴隨的發(fā)光

4、現(xiàn)象.磷光:由最低的電子激發(fā)三重態(tài)所產(chǎn)生的輻射躍遷而伴隨的發(fā)光現(xiàn)象. 按激發(fā)模式分類,可分為:a.光致發(fā)光:分子因吸收外來輻射的光子能量被激發(fā)所產(chǎn)生的發(fā)光.b.化學(xué)發(fā)光:分子的激發(fā)能量是由反應(yīng)的化學(xué)能提供.c.生物發(fā)光:分子的激發(fā)能量是由生物體釋放出來的能量提供.d.熱致發(fā)光:由熱活化的離子復(fù)合激發(fā)模式所引起的發(fā)光現(xiàn)象.e.場(chǎng)致發(fā)光:由電荷注入激發(fā)模式所產(chǎn)生的發(fā)光.f.摩擦發(fā)光:由摩擦激發(fā)模式所產(chǎn)生的發(fā)光.單重態(tài)和三重態(tài)單重態(tài)和三重態(tài) 電子激發(fā)態(tài)的多重度電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1 S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或或1)； 單重態(tài)單重態(tài)：全部軌道里的電子都是自旋配對(duì)

5、的，：全部軌道里的電子都是自旋配對(duì)的，S=0,M=1； 三重態(tài)：三重態(tài)：分子具有自旋不配對(duì)的電子，分子具有自旋不配對(duì)的電子，S=1,M=3.平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；態(tài)能級(jí)低； 大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)； 基態(tài)單重態(tài)基態(tài)單重態(tài)激發(fā)單重態(tài)激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)激發(fā)三重態(tài)區(qū)別：電子自旋方向不同，激發(fā)三重態(tài)的能級(jí)稍低一些。區(qū)別：電子自旋方向不同，激發(fā)三重態(tài)的能級(jí)稍低一些。電子躍遷類型電子躍遷類型允許躍遷允許躍遷禁阻躍遷禁阻躍遷S0S1, S2, S3T1, T2, T3 在

6、單重激發(fā)態(tài)中，兩個(gè)電子平行自旋，在單重激發(fā)態(tài)中，兩個(gè)電子平行自旋，單重態(tài)分子單重態(tài)分子具有具有抗磁性抗磁性，其激發(fā)態(tài)的，其激發(fā)態(tài)的平均壽平均壽命命大約為大約為10-8s，而，而三重態(tài)三重態(tài)分子具有分子具有順磁性順磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命為其激發(fā)態(tài)的平均壽命為10-4 1s以上（通常用以上（通常用S和和T分別表示單重態(tài)和三重態(tài)）。分別表示單重態(tài)和三重態(tài)）。 電子躍遷類型電子躍遷類型激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相反，稱為激發(fā)單重態(tài)激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相反，稱為激發(fā)單重態(tài) （S）抗磁性）抗磁性激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相同，稱為激發(fā)三重態(tài)激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相同，稱為激發(fā)三重態(tài) （

7、T）順磁性）順磁性區(qū)別：電子自旋方向不同，區(qū)別：電子自旋方向不同，激發(fā)三重態(tài)的能級(jí)稍低一些。激發(fā)三重態(tài)的能級(jí)稍低一些。電子躍遷電子躍遷 處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式輻射躍遷方式或或無無 輻射躍遷方式輻射躍遷方式再回到基態(tài)。再回到基態(tài)。 輻射躍遷輻射躍遷主要涉及到主要涉及到熒光、延遲熒光熒光、延遲熒光或或磷光磷光的發(fā)的發(fā) 射；射； 無輻射躍遷無輻射躍遷則是指以熱的形式輻射其多余的能則是指以熱的形式輻射其多余的能 量，包括量，包括振動(dòng)弛豫（振動(dòng)弛豫（VR）、內(nèi)轉(zhuǎn)移（內(nèi)轉(zhuǎn)移（IR）、外外 轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移（EC）及及系間竄越系間竄越（ISC）等，各種躍遷方）等，各種躍遷方

8、式發(fā)生的可能性及程度，與式發(fā)生的可能性及程度，與熒光物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)熒光物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu) 及及激發(fā)時(shí)的物理和化學(xué)環(huán)境等因素激發(fā)時(shí)的物理和化學(xué)環(huán)境等因素有關(guān)。有關(guān)。處于單線態(tài)和三線態(tài)下的分子的電子受激發(fā)激發(fā)單重(線)態(tài)：分子吸收能量，電子自旋仍然配對(duì)，為單重(線)態(tài)，稱為激發(fā)單重態(tài)，以S1，S2表示激發(fā)三重(線)態(tài)：分子吸收能量，電子自旋不再配對(duì)為三重，稱為激發(fā)三重態(tài)，以T1，T2.表示?；鶓B(tài)：電子自旋配對(duì)多重度=2s+1=1，為單重(線)態(tài)，以S0表示。分子的去激發(fā)分子的去激發(fā)無輻射躍遷無輻射躍遷輻射躍遷輻射躍遷熒光（熒光（F）磷光（磷光（P）振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)移內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移體系間跨越體系

9、間跨越分子的去激發(fā)分子的去激發(fā)輻射躍遷輻射躍遷熒光：熒光：受光激發(fā)的分子從受光激發(fā)的分子從第一激發(fā)單重態(tài)第一激發(fā)單重態(tài)的最低振的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。壽命為動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。壽命為10-8 10 -11s。由于是相同多重態(tài)之間的躍遷，幾率較大，速度大，由于是相同多重態(tài)之間的躍遷，幾率較大，速度大，速率常數(shù)速率常數(shù)kf為為106109s-1。 磷光：磷光： 從從第一激發(fā)三重態(tài)第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。由于磷光的產(chǎn)生伴隨自旋多重態(tài)的所發(fā)出的輻射。由于磷光的產(chǎn)生伴隨自旋多重態(tài)的改變，輻射速度遠(yuǎn)小于熒光，磷光壽命為改變，輻射速度遠(yuǎn)小于

10、熒光，磷光壽命為10-4 10s。在光照停止后，仍可持續(xù)一段時(shí)間在光照停止后，仍可持續(xù)一段時(shí)間。振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫它是指它是指 在同一電子能級(jí)在同一電子能級(jí)中，中，電子由高振動(dòng)電子由高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至低振動(dòng)能級(jí)，而將多余的能量以能級(jí)轉(zhuǎn)至低振動(dòng)能級(jí)，而將多余的能量以熱的形式發(fā)出熱的形式發(fā)出。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間為。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間為10-12s數(shù)量級(jí)數(shù)量級(jí)。無輻射躍遷無輻射躍遷內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換 當(dāng)當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)兩個(gè)電子能級(jí)非?？拷灾疗湔駝?dòng)能非常靠近以至其振動(dòng)能級(jí)有級(jí)有重疊重疊時(shí)，常發(fā)生電子由高能級(jí)以時(shí)，常發(fā)生電子由高能級(jí)以無輻無輻射躍遷方式射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級(jí)。轉(zhuǎn)移至低能級(jí)。無輻射躍遷無輻射躍遷外轉(zhuǎn)移

11、外轉(zhuǎn)移 指激發(fā)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相指激發(fā)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)移，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至互作用及能量轉(zhuǎn)移，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失。這一現(xiàn)象稱為消失。這一現(xiàn)象稱為“熄滅熄滅”或或“猝滅猝滅”。熒光與磷光的根本區(qū)別熒光與磷光的根本區(qū)別： 熒光熒光是由激發(fā)是由激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)各最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的；而振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的；而磷光磷光是由是由激發(fā)三重態(tài)激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的。的最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的。無輻射躍遷無輻射躍遷系間竄越系間竄越指指不同多重態(tài)間不同多重態(tài)間的的無輻射

12、躍遷無輻射躍遷，例如例如S1T1就是一種體系間跨躍。就是一種體系間跨躍。通常，發(fā)生體系間跨躍時(shí)，電子通常，發(fā)生體系間跨躍時(shí)，電子由由S1的較低振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)移至的較低振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)移至T1的的較高振動(dòng)能級(jí)處。有時(shí)，通過熱較高振動(dòng)能級(jí)處。有時(shí)，通過熱激發(fā)，有可能發(fā)生激發(fā)，有可能發(fā)生T1S1，然后，然后由由S1發(fā)生熒光。這是產(chǎn)生發(fā)生熒光。這是產(chǎn)生延遲熒光的機(jī)理延遲熒光的機(jī)理。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋軌道耦合進(jìn)行。軌道耦合進(jìn)行。無輻射躍遷無輻射躍遷hvAhvFS1T1S0hvP熒光產(chǎn)生的基本原理內(nèi)轉(zhuǎn)換（Internal Conversion，IC）: 對(duì)于具有相同多重

13、度相同多重度的分子，若較高電子能級(jí)的低振動(dòng)能層與較低電子能級(jí)的高振動(dòng)能層相重疊時(shí)，則電子可在重疊的能層之間通過振動(dòng)耦合產(chǎn)生無輻射躍遷，如S2-S1；T2-T1。系間跨躍（Intersystem Conversion，ISC）:系間跨躍是發(fā)生在兩個(gè)不同多重態(tài)之間的無輻射躍遷，如從S1到T1，該躍遷是禁阻的。然而，當(dāng)不同多重態(tài)的兩個(gè)電子能層有較大重疊時(shí)，處于這兩個(gè)能層上的受激電子的自旋方向發(fā)生變化，即可通過自旋-軌道耦合而產(chǎn)生無輻射躍遷，該過程稱為系間跨躍。熒光:分子電子從單重激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)在很短時(shí)間（10-9-10-6s）躍遷到基態(tài)各振動(dòng)能層時(shí)所產(chǎn)生的光子輻射稱為熒光。磷光: 分子電子從三

14、重態(tài)最低振動(dòng)能層，躍遷到基態(tài)的各振動(dòng)能層所產(chǎn)生的輻射。S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)換l l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫5）熒光發(fā)射 分子電子從單重激發(fā)態(tài)（Kasha規(guī)則）的最低振動(dòng)能級(jí)在很短時(shí)間（10-9-10-6s）躍遷到基態(tài)各振動(dòng)能層時(shí)所產(chǎn)生的光子輻射稱為熒光。由于各種去活化過程的存在，熒光輻射能通常要比激發(fā)能量低，或者說，熒光波長(zhǎng)大于激發(fā)波長(zhǎng)（Stokes效應(yīng)）。6）磷光發(fā)射 從單重態(tài)到三重態(tài)分子間發(fā)生系間跨躍躍遷后，再經(jīng)振動(dòng)弛豫回到三重態(tài)最低振動(dòng)能層，最后，在10-4-10s

15、內(nèi)躍遷到基態(tài)的各振動(dòng)能層所產(chǎn)生的輻射。0 0S S光光發(fā)發(fā)射射（低低振振動(dòng)動(dòng)能能層層）1 1T T振振動(dòng)動(dòng)弛弛豫豫（高高振振動(dòng)動(dòng)能能層層）1 1T T系系間間跨跨躍躍1 1S S磷磷熒光的類型發(fā)射機(jī)制考慮：瞬時(shí)熒光和遲滯熒光（1）.瞬時(shí)熒光:通常在吸收激發(fā)光后大約10-8s 內(nèi)發(fā)射的,是由激發(fā)過程中最初生成的S1電子態(tài)所產(chǎn)生的輻射.瞬時(shí)熒光可能由處于S1電子態(tài)的分子或S1激發(fā)態(tài)分子與基態(tài)分子所形成的激發(fā)態(tài)二聚體產(chǎn)生的.低濃度(10-6M)芘溶液,熒光是紫色的,熒光光譜有結(jié)構(gòu)特征高濃度(10-3M)芘溶液,熒光是藍(lán)色的,熒光光譜沒有結(jié)構(gòu)特征(2).遲滯熒光 物質(zhì)分子在剛性或粘稠介質(zhì)中,除了磷光譜

16、外,還可能觀察到另一種長(zhǎng)壽命的發(fā)射譜帶,但這個(gè)發(fā)射譜帶波長(zhǎng)比磷光譜帶波長(zhǎng)要短.往往把這種長(zhǎng)壽命發(fā)射的譜帶稱為遲滯熒光.遲滯熒光分為E-型遲滯熒光,P-型遲滯熒光和復(fù)合熒光三種類型.E-型遲滯熒光:處于T1電子態(tài)的分子,經(jīng)熱活化提高能量后而處于S1電子能態(tài),然后自S1電子態(tài)輻射躍遷產(chǎn)生熒光.P-型遲滯熒光: 這類熒光,其S1電子激發(fā)分子的布居,是由兩個(gè)處于T1電子態(tài)的分子相互作用時(shí)所引起的,此過程稱為“三重態(tài)-三重態(tài)粒子湮(yan)沒”,結(jié)果產(chǎn)生一個(gè)激發(fā)單重態(tài)分子.復(fù)合熒光其第一電子激發(fā)單重態(tài)分子的布居，是由自由基離子和電子復(fù)合或具有相反電荷的兩個(gè)自由基離子復(fù)合引起的。熒光的類型n比較熒光和激發(fā)

17、光的波長(zhǎng)考慮：n.斯托克斯（stokes)熒光n.反斯托克斯熒光（antistokes)n.共振熒光.斯托克斯（stokes)熒光 在溶液中觀察到的熒光,其發(fā)射的熒光比激發(fā)光的波長(zhǎng)要長(zhǎng).激發(fā)光熒光分子碰撞引起的能量損失S0S1.反斯托克斯熒光（antistokes) 如果在吸收光子的過程又附加熱能給予激發(fā)態(tài)分子,則發(fā)射的熒光波長(zhǎng)比激發(fā)光的波長(zhǎng)短.這種熒光可在高溫的稀薄氣體中觀察到.激發(fā)光熒光吸收熱能S0S1.共振熒光 與激發(fā)光具有相同波長(zhǎng)的熒光,這類熒光在氣體和結(jié)晶才有可能發(fā)生. 激發(fā)光熒光S0S1熒光的檢測(cè)熒光的檢測(cè)單色器單色器光源光源檢測(cè)器檢測(cè)器狹縫狹縫單色器單色器吸吸收收池池狹縫狹縫ex

18、emI0It熒光測(cè)量熒光測(cè)量熒光的檢測(cè) 光譜特征 任何熒（磷）光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒（磷）光定性分析的基礎(chǔ)。1）激發(fā)光譜 改變激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量在最強(qiáng)熒（磷）光發(fā)射波長(zhǎng)處的強(qiáng)度變化，以激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度作圖可得到激發(fā)光譜。 激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！這是因?yàn)榉肿游展饽艿倪^程就是分子的激發(fā)過程。 激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)；在定量時(shí)，用于選擇最適宜的激發(fā)波長(zhǎng)。2）發(fā)射光譜）發(fā)射光譜發(fā)射光譜即熒光光譜。一定波長(zhǎng)和強(qiáng)度的激發(fā)波發(fā)射光譜即熒光光譜。一定波長(zhǎng)和強(qiáng)度的激發(fā)波長(zhǎng)輻照熒光物質(zhì)，產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的強(qiáng)度的熒光，長(zhǎng)輻照熒光物質(zhì)，產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的強(qiáng)度

19、的熒光，以熒光強(qiáng)度對(duì)其波長(zhǎng)作圖可得熒光發(fā)射光譜。以熒光強(qiáng)度對(duì)其波長(zhǎng)作圖可得熒光發(fā)射光譜。 由于不同物質(zhì)具不同的特征發(fā)射峰，因而使用由于不同物質(zhì)具不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)。熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)。激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 由于分子對(duì)光的選擇性吸收,不同波長(zhǎng)的入射光便具有不同的激發(fā)效率.如果固定熒光的發(fā)射波長(zhǎng)(即測(cè)定波長(zhǎng),不斷改變激發(fā)光(入射光)的波長(zhǎng),并記錄相應(yīng)的熒光強(qiáng)度.所得到的熒光強(qiáng)度對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)的譜圖稱為熒光的激發(fā)光譜.如果使激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度保持不變,而不斷改變熒光的測(cè)定波長(zhǎng)(發(fā)射波長(zhǎng))并記錄相應(yīng)的熒光強(qiáng)度,所得到的熒光強(qiáng)度對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)的譜圖則為熒光的發(fā)射光

20、譜. 由于不同物質(zhì)具不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)。如右圖所示。i）波長(zhǎng)比較 與激發(fā)（或吸收）波長(zhǎng)相比，熒光發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng)，即產(chǎn)生所謂Stokes位移。（振動(dòng)弛豫失活所致）ii）形狀比較 熒光光譜形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)。盡管分子受激后可到達(dá)不同能層的激發(fā)態(tài)，但由于去活化（內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫）到第一電子激發(fā)態(tài)的速率或幾率很大，好像是分子受激只到達(dá)第一激發(fā)態(tài)一樣。 換句話說，不管激發(fā)波長(zhǎng)如何，電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層。激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系溫州大學(xué)化材學(xué)院微納結(jié)構(gòu)材料 & 物理化學(xué)研究所iii）鏡像對(duì)稱）鏡像

21、對(duì)稱 通常熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系通常熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系 熒光為第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能層躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層而形成，即其形狀與基態(tài)振動(dòng)能級(jí)分布有關(guān)。 吸收光譜是由基態(tài)最低振動(dòng)能層躍遷到第一電子激發(fā)單重態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層而形成，即其形狀與第一電子激發(fā)單重態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布有關(guān)。 由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)的振動(dòng)能層分布具有相似性，因而呈鏡像對(duì)稱。解釋解釋1：能層結(jié)構(gòu)相似性：能層結(jié)構(gòu)相似性熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率nF1和F2分別表示待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率；F1和F2分別表示待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的積分熒光強(qiáng)度；A1和A2分別表示待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)在激發(fā)

22、波長(zhǎng)下的吸光度。(硫酸喹啉在0.05mol/L硫酸中的熒光量子產(chǎn)率為0.55,是測(cè)量熒光量子產(chǎn)率時(shí)經(jīng)常使用的一種參照物.)熒光量子產(chǎn)率的測(cè)量方法分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系 產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件：產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件： i）分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)）分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)（內(nèi)因）；（內(nèi)因）； ii）吸收特征頻率的光后，應(yīng)可產(chǎn)生具一定）吸收特征頻率的光后，應(yīng)可產(chǎn)生具一定量子效率的熒光。量子效率的熒光。即量子效率即量子效率 F足夠大：足夠大：吸吸收收的的光光量量子子數(shù)數(shù)發(fā)發(fā)射射的的熒熒光光量量子子數(shù)數(shù) F=kf/(kf+K)分子結(jié)構(gòu)與熒光分子結(jié)構(gòu)與熒光1）躍遷

23、類型：）躍遷類型： 通常，具有通常，具有 *及及n *躍遷結(jié)構(gòu)的分子躍遷結(jié)構(gòu)的分子才會(huì)產(chǎn)生熒光。而且具才會(huì)產(chǎn)生熒光。而且具 *躍遷的熒光效率比躍遷的熒光效率比 n *躍遷的要大得多。躍遷的要大得多。2）共軛效應(yīng)：）共軛效應(yīng)： 共軛度越大，熒光越強(qiáng)。共軛度越大，熒光越強(qiáng)。共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系lex=205nmlex=286nmlex=356nmlem=278nmlem=321nmlem=404nmF=0.11F=0.29F=0.36提高共軛度有利于提高共軛度有利于增加熒光效率增加熒光效率并產(chǎn)生并產(chǎn)生紅移紅移。分子結(jié)構(gòu)與熒光分子結(jié)構(gòu)與熒光3）剛性結(jié)構(gòu)和共平面性）剛性結(jié)構(gòu)和共平面

24、性：分子分子剛性剛性（Rigidity）越強(qiáng)越強(qiáng)，分子，分子振動(dòng)少振動(dòng)少，與其它分子碰撞失活的機(jī)率下降，與其它分子碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量熒光量子效率提高子效率提高。如熒光素（如熒光素（ 大）與酚酞（大）與酚酞（ =0）；）；分子結(jié)構(gòu)與熒光分子結(jié)構(gòu)與熒光剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系OHNNOMg1/28 羥基喹啉羥基喹啉8 羥基喹啉鎂羥基喹啉鎂形成絡(luò)合物后形成絡(luò)合物后, ,形成剛性平面形成剛性平面剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系SO3NaNCH3CH3SO3NaNCH3H3C7 - 二甲胺萘二甲胺萘 1 - 磺酸鹽磺酸鹽 F =0.

25、758 - 二甲胺萘二甲胺萘 1 - 磺酸鹽磺酸鹽 F =0.03空間位阻與熒光的關(guān)系空間位阻與熒光的關(guān)系剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系CCHHCCHH反式結(jié)構(gòu)，發(fā)光反式結(jié)構(gòu)，發(fā)光順式結(jié)構(gòu)，不發(fā)光順式結(jié)構(gòu)，不發(fā)光1，2二苯乙烯二苯乙烯空間位阻與熒光的關(guān)系空間位阻與熒光的關(guān)系分子結(jié)構(gòu)與熒光分子結(jié)構(gòu)與熒光4）取代基：）取代基： 給電子取代基增強(qiáng)熒光（給電子取代基增強(qiáng)熒光（p- 共軛），如共軛），如 -OH、-OR、 -NH2、-NR2等；等； 吸電子基降低熒光，如吸電子基降低熒光，如 -COOH、 -C=O、 -NO2、-NO、-X等；等； 重原子降低熒光但增強(qiáng)磷光，

26、重原子降低熒光但增強(qiáng)磷光， 如苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐如苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱到消失，該現(xiàn)象也稱重原子效應(yīng)。漸減弱到消失，該現(xiàn)象也稱重原子效應(yīng)。取代基的影響取代基的影響OH 給電子取代基給電子取代基 增強(qiáng)熒光增強(qiáng)熒光NH2, NHR, NR2, OH, OR, 等等l lEM285-365 nm270-310 nm310-405 nm相對(duì)熒光強(qiáng)度相對(duì)熒光強(qiáng)度 1.8 1.0 2.0NHH 吸電子取代基吸電子取代基N+OOCOCOOn 電子不與電子不與 電子共軛電子共軛羰基類羰基類 1）n* 躍遷禁阻，躍遷禁阻， 小，小，10-22）最低單重態(tài)為）最低單重態(tài)為 n

27、, * 型，易于型，易于ISC。熒光弱，磷光強(qiáng)熒光弱，磷光強(qiáng)非熒光非熒光強(qiáng)熒光強(qiáng)熒光OOOHOH取代基的位置取代基的位置COOHOHCOHOHO1） 有利于有利于電子離域的，則熒光增強(qiáng)。電子離域的，則熒光增強(qiáng)。 因此，一般因此，一般鄰位、對(duì)位鄰位、對(duì)位給電子基團(tuán)導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。給電子基團(tuán)導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。2）有利于形成環(huán)，導(dǎo)致分子剛性增大，熒光增強(qiáng)。）有利于形成環(huán)，導(dǎo)致分子剛性增大，熒光增強(qiáng)。熒光強(qiáng)度較弱熒光強(qiáng)度較弱熒光強(qiáng)度較強(qiáng)熒光強(qiáng)度較強(qiáng)COOHCOOHOHHO重原子效應(yīng)重原子效應(yīng)重原子降低熒光但增強(qiáng)磷光重原子降低熒光但增強(qiáng)磷光 如苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯如苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱

28、到消失，該現(xiàn)象也稱重原子效應(yīng)。到碘苯，熒光逐漸減弱到消失，該現(xiàn)象也稱重原子效應(yīng)。NNNNOH3CCH3CH3O F 0.22 10-5 P 0.14 0.43 P 1.9 s 0.024 sNNNNSH3CCH3CH3O重原子效應(yīng)重原子效應(yīng)不含有雜原子（不含有雜原子（N,O,S）的有機(jī)化合物均屬于這一）的有機(jī)化合物均屬于這一類，其特點(diǎn)是類，其特點(diǎn)是自旋允許躍遷自旋允許躍遷， 大，大， 104，熒光強(qiáng)熒光強(qiáng) , *1) 含有雜原子（含有雜原子（N,O,S）的有機(jī)化合物多屬于這一）的有機(jī)化合物多屬于這一類，含有類，含有n 電子，其特點(diǎn)是電子，其特點(diǎn)是自旋禁阻自旋禁阻 ， 小，小， 102, ISC

29、速率大速率大，熒光弱熒光弱。2) n 軌道的能量受環(huán)境的影響大軌道的能量受環(huán)境的影響大，如質(zhì)子化或生成，如質(zhì)子化或生成氫鍵等，將使氫鍵等，將使n 軌道的能量降低，導(dǎo)致軌道的能量降低，導(dǎo)致n*躍遷的躍遷的能量增大。熒光分子的最低激發(fā)態(tài)可能變成能量增大。熒光分子的最低激發(fā)態(tài)可能變成 , *。分為兩類分為兩類 含氮雜環(huán)有機(jī)物含氮雜環(huán)有機(jī)物含羰基雜原子有機(jī)物含羰基雜原子有機(jī)物 n, *最低單重態(tài)的性質(zhì)最低單重態(tài)的性質(zhì)含氮雜環(huán)有機(jī)物含氮雜環(huán)有機(jī)物熒光隨溶劑極性的增大而增強(qiáng)熒光隨溶劑極性的增大而增強(qiáng)例例1 喹啉喹啉介質(zhì)介質(zhì) 苯苯 乙醇乙醇 水水相對(duì)熒光相對(duì)熒光 1 30 1000N可以理解為可以理解為N上

30、的孤對(duì)電子與水形成氫鍵，使上的孤對(duì)電子與水形成氫鍵，使n軌道能量軌道能量降低，從而使最低單重激發(fā)態(tài)由降低，從而使最低單重激發(fā)態(tài)由n, *變成變成 , *。含羰基有機(jī)物含羰基有機(jī)物芳香類芳香類S1與與T1能級(jí)間隙小，能級(jí)間隙小， ISC效率高，接近于效率高，接近于1。脂肪類脂肪類有微弱的熒光，有微弱的熒光，ISC效率低一些效率低一些影響熒光的外界因素影響熒光的外界因素（一）溶劑效應(yīng)：（一）溶劑效應(yīng)： 溶劑極性可增加或降低熒光強(qiáng)度溶劑極性可增加或降低熒光強(qiáng)度 （改變（改變 *及及n * 躍遷的能量）；躍遷的能量）； 與溶劑作用從而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)來增與溶劑作用從而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)來增加或降低熒光強(qiáng)

31、度。加或降低熒光強(qiáng)度。影響熒光的外界因素影響熒光的外界因素（二）溫度：（二）溫度： 溫度增加，熒光強(qiáng)度下降（因?yàn)閮?nèi)、外轉(zhuǎn)換溫度增加，熒光強(qiáng)度下降（因?yàn)閮?nèi)、外轉(zhuǎn)換增加、粘度或增加、粘度或“剛性剛性”降低）。因此體系降低溫降低）。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度。度可增加熒光分析靈敏度。影響熒光的外界因素影響熒光的外界因素（三）（三）pH值：值： 具酸或堿性基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)，在不同具酸或堿性基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)，在不同pH值值時(shí)，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強(qiáng)度將發(fā)生時(shí)，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強(qiáng)度將發(fā)生改變；對(duì)無機(jī)熒光物質(zhì)，因改變；對(duì)無機(jī)熒光物質(zhì)，因pH值會(huì)影響其穩(wěn)定值會(huì)影響其穩(wěn)定性，因而也可使

32、其熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。性，因而也可使其熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。OH-H+NH4+H+OH-NH2NH-pH 13pH712影響熒光的外界因素影響熒光的外界因素（四）內(nèi)濾光和自吸：（四）內(nèi)濾光和自吸： 體系內(nèi)存在可以吸收熒光的物質(zhì)，或體系內(nèi)存在可以吸收熒光的物質(zhì)，或熒光物質(zhì)的熒光短波長(zhǎng)與激發(fā)光長(zhǎng)波長(zhǎng)有熒光物質(zhì)的熒光短波長(zhǎng)與激發(fā)光長(zhǎng)波長(zhǎng)有重疊，均可使熒光強(qiáng)度下降，稱為內(nèi)濾光；重疊，均可使熒光強(qiáng)度下降，稱為內(nèi)濾光；當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時(shí)，可吸收自身的熒當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時(shí)，可吸收自身的熒光發(fā)射稱為熒光自吸。光發(fā)射稱為熒光自吸。熒光猝滅熒光猝滅Hhvhvk*,k*1QMQMMMMM2 *,*hvhvAADD )

33、(A)D()A()(D)(A)D()A()(D1*0011*001SSSTSSSS* NCH3CH3NCH3CH3+_熒光猝滅熒光猝滅23*3231OMOM 1k*kT M2M)M(MM*3*3*3熒光猝滅熒光猝滅*hvhvDDDD D)(DDD11* 熒光猝滅熒光猝滅單色器單色器單色器單色器光源光源。 檢測(cè)器檢測(cè)器液液 槽槽放大和指示儀表放大和指示儀表熒光分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)示意圖熒光分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)示意圖I0I儀器結(jié)構(gòu)示意圖儀器結(jié)構(gòu)示意圖儀器與技術(shù)儀器與技術(shù)n 熒光計(jì)的主要部件熒光計(jì)的主要部件1 1）光源：）光源：氙燈、高壓汞燈、激光；氙燈、高壓汞燈、激光；2 2）樣品池：）樣品池：石英（低熒

34、光材料）；石英（低熒光材料）；3 3）兩個(gè)單色器：）兩個(gè)單色器： 選擇激發(fā)光單色器；分離熒光單色器；選擇激發(fā)光單色器；分離熒光單色器；4 4）檢測(cè)器：）檢測(cè)器：光電倍增管。光電倍增管?；狙b置及主要構(gòu)件基本裝置及主要構(gòu)件1 1、激發(fā)光源、激發(fā)光源 （1）條件: 足夠的強(qiáng)度 紫外，可見區(qū)域有連續(xù)的光譜 強(qiáng)度與波長(zhǎng)無關(guān) 光強(qiáng)穩(wěn)定（2）激發(fā)光源: 氙燈（高壓）: 2501000nm光譜區(qū)呈連續(xù)光譜，使用壽命大約為2000h。 汞燈（高壓）:在紫外區(qū)激發(fā)，365nm，使用壽命 15003000小時(shí)。2 2、單色器、單色器 光柵單色器 有較高的靈敏度，較寬的波長(zhǎng)范圍，能掃描光譜，主要缺點(diǎn)是雜散光較大，有

35、不同級(jí)次的譜線干擾，可用前置濾光片加以消除。 濾光片 濾光片便宜簡(jiǎn)便，在熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)中有廣泛的應(yīng)用。 基本裝置及主要構(gòu)件基本裝置及主要構(gòu)件3、樣品池 石英方形池，四面都透光。 4、狹縫 狹縫越小，單色性越好，但光強(qiáng)和靈敏度降低。 基本裝置及主要構(gòu)件基本裝置及主要構(gòu)件5、檢測(cè)器光電倍增管：靈敏度高，線路簡(jiǎn)單。光電攝像管：具有檢測(cè)效率高，動(dòng)態(tài)范圍 寬，線性響應(yīng)好，堅(jiān)固耐用和壽命長(zhǎng)特點(diǎn)。6、讀出裝置 記錄儀、陰極示波器和顯示器?；狙b置及主要構(gòu)件基本裝置及主要構(gòu)件熒光定量分析熒光定量分析CLteTLCIITA303. 20,lglgLC.teTII30320111)1 (303200LC.

36、teIII)1 ()(303200LC.tFeIIII!nx!4x!3x!2x!1x1en432x )!4)bC30. 2(!3)bC30. 2(!2)bC30. 2(bC30. 2(II4320F CLIkIFF030. 2CLIkIPP030. 2CKIF KCIP 熒光定量分析熒光定量分析熒光分析的特點(diǎn)：熒光分析的特點(diǎn)： 靈敏度高靈敏度高：視不同物質(zhì)，檢測(cè)下限在視不同物質(zhì)，檢測(cè)下限在0.10.0010.10.001 g/mLg/mL之之間?？砷g?？?見比見比UV-VisUV-Vis的靈敏度高得多！的靈敏度高得多！ 選擇性好選擇性好：可同時(shí)用激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜定性?？赏瑫r(shí)用激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜定性。 結(jié)構(gòu)信息量多結(jié)構(gòu)信息量多：包括物質(zhì)激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、光強(qiáng)、包括物質(zhì)激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、