野外采樣實驗

1、野外采樣實驗野外取樣實驗方案（201604）1. 實驗目的研究自然條件下東南景天不同生育期間，其內(nèi)生菌多樣性的動態(tài)變化。2. 實驗設計選擇在東南景天的 苗期、開花期、成熟期，于浙江衢州鉛鋅礦山采集具有 代表性5個樣點的超累積生態(tài)型東南景天，混合為一個樣品并將其連同根際土 壤放入無菌的塑料箱中，地上部裸露于袋外，保持鮮活狀態(tài)，帶回實驗室，然 后進行后續(xù)處理。3. 實驗內(nèi)容（1）powersoil試劑盒提取根際土壤菌DNA（2）可培養(yǎng)植物內(nèi)生菌分離（3）CTAB法提取植物內(nèi)生菌DNA（4）植物重金屬含量測定（5）土壤理化性質(zhì)測定實驗一 powersoil試劑盒提取根際土壤菌DNA1. 實驗目的po

2、wersoil試劑盒提取根際土壤菌DNA，保存，待之后送檢2. 實驗步驟（1）獲取東南景天根際土壤小心把東南景天從土壤中取出，用鑷子夾取粘附在根表的土壤。每個樣點 夾取約3g 土壤，取1g立即提取DNA，余下裝入封口袋，（？）-20C保存。（取出的東南景天表面洗凈，晾干。測量鮮重后，殺青，烘干。測量干重后，研磨，待測。植物重金屬含量，3個重復，每個重復0.1g，共需要植物根莖 葉鮮重各5g）（2）選取 Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit （MO BIO Laboratories, Inc, Carlsbad, CA ）試劑盒提取土壤樣品DNA。具體操作步驟如下：

3、1） 稱取約0.25g 土壤樣品，放入研磨珠套管（PowerBead Tubes），渦旋混勻。2）套管中加入60卩I C1溶液（裂解緩沖液），顛倒數(shù)次，渦旋5s混勻。3） 將套管放入水平渦旋振蕩儀，在最大速度振蕩10min。4）取出套管，在室溫下10000溝離心30so5）把上清液（約400500訓轉(zhuǎn)移到新的2mL離心管。6） 加250卩IC2容液（抑制物去除液）至離心管中，渦旋5s, 4C下放置5min , 在室溫下10000旳 離心1min。7）將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的2mL離心管，總體積不超過600卩,同時避免吸出 沉淀物。8） 加200卩I C3容液（抑制物去除液）至離心管中，渦旋混勻，

4、4C下放置5min， 在室溫下10000旳 離心1min。9）將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的2mL離心管，總體積不超過750門同時避免吸出 沉淀物。10）加1.2mL C4溶液（高鹽溶液）至離心管中，渦旋混勻，從離心管中抽取約650卩溶液至離心過濾管（Spin Filter ）。11）在室溫下10000%離心1min，取出管中過濾柱，棄去液體，過濾柱放回管 中。12） 加入第10步離心管中約650卩溶液，重復第（11）步操作，加入第10步離心管 中剩余的溶液，重復第11步操作。13） 加500卩l(xiāng) C5容液（乙醇淋洗緩沖液）至離心過濾管中，在室溫下10000% 離心30s，棄去管中液體。14）在室溫下

5、10000%離心1min。15）取出過濾柱小心放入新的2mL離心管中，避免任何 C5溶液濺到過濾柱上。16）加入60卩I C6溶液（DNA洗脫液）或無菌超純水至過濾柱白色薄膜中，在 室溫下10000%g離心30so17）棄去離心柱，提取完成。分裝-20 C保存，待下一步應用。實驗二 可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的分離純化保存1. 實驗目的（1）分離東南景天內(nèi)生菌，記錄菌落數(shù)，菌落種類數(shù)，菌落形態(tài)，優(yōu)勢菌菌落 數(shù)。（2）困洛純化，保存困種。2. 儀器和試劑2.1內(nèi)生菌分離（1）需要干熱滅菌的儀器培養(yǎng)皿150個（其中在15個培養(yǎng)皿中放入濾紙）150mL燒杯75個研砵15個（2）需要高溫濕熱滅菌的儀器R2A培養(yǎng)基

6、3000mL，分裝至15個250mL三角瓶磷酸緩沖溶液150mL，至于200mL滅菌瓶試管+蒸餾水（2*3*5=30支試管）2000mL蒸餾水，裝入1000mL三角瓶1mL槍頭兩盒（其中30個需要剪缺口）錫箔紙50張（3）其他試劑99%酒精、35%雙氧水、3%次氯酸鈉2.2內(nèi)生菌純化保存（1）需要干熱滅菌的儀器培養(yǎng)皿50個（2）需要高溫濕熱滅菌的儀器50%甘油150mL （約150個菌種用量），倒入200mL滅菌瓶。150個凍存管，用保鮮袋包裝。R2A固體培養(yǎng)基1000mL，分裝至5個250mL三角瓶。R2A液體培養(yǎng)基1000mL，分裝至50個50mL三角瓶。3. 實驗步驟3.1植物樣品表面（

7、消毒滅菌燒杯：15個植物樣5=75個）制作2000mL無菌水。分別取4g植物樣在自來水下沖洗 一一99%酒精（1min ） 35%雙氧水+3%次氯酸鈉（30min）無菌水沖洗三次取0.3g植物樣用錫箔紙包裝，做3個重復，液氮速凍，-80 C保存3.2可培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)及純化保存（1）細菌的培養(yǎng)基配方R2A培養(yǎng)基（1000ml蒸餾水，酵母粉0.5g、胰蛋白胨0.5g、酪蛋白氨基酸 0.5g、葡萄糖 0.5g、可溶性淀粉 0.5g、KH 2PO40.3g、MgSO4 7H2O: 0.05g、丙 酮酸鈉 0.2g, pH 7.2）配制R2A培養(yǎng)基3000mL，分裝至15個250mL三角瓶，高溫濕熱滅菌

8、121°C,20min。（2）磷酸緩沖溶液（滅菌處理）磷酸緩沖溶液：0.8g 氯化鈉；0.02gKH 2PO4； 0.11gNa2HPO4 ； 0.02gKCI; 100ml蒸餾水；PH值7.4。配制磷酸緩沖溶液150mL，至于200mL滅菌瓶，高溫濕熱滅菌121C ,20min。（3）研磨把消毒后的葉、莖和根，分別放在滅菌的研缽中，研磨成汁，加入3ml的磷酸緩沖溶液，攪拌均勻，靜置 10分鐘，再攪拌。（4）稀釋（2*3*5=30支試管）從研缽中取1ml的溶液分別稀釋10倍、100倍（5）涂布分別從原液、10倍、100倍的溶液中取200微升到細菌的培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 每個梯度做3個平行。

9、（用酒精浸泡，燒的時間長一些，葉、莖，考慮用不同的 三角刮刀）（15個植物樣*3個濃度*3個重復=135個平板）（6）平板培養(yǎng)一星期后，計數(shù)，并記錄其菌落形態(tài)。同時，根據(jù)菌落特征。（7）菌種純化保存（約50個菌種用量）配制50%甘油150mL （約150個菌種用量），倒入200mL滅菌瓶。準備150個凍存管，用保鮮袋包裝。配制R2A固體培養(yǎng)基1000mL，分裝至5個250mL三角瓶，配制R2A液 體培養(yǎng)基1000mL，分裝至50個50mL三角瓶。以上儀器試劑使用高溫濕熱滅菌 121C ,20min。挑選不同的菌落到新的培 養(yǎng)基, 純化 1次。挑單個菌落到R2A液體培養(yǎng)基中，30 C、160r/

10、min，搖床12-16小時，搖 到對數(shù)期或?qū)?shù)末期，測0D值，取700 uL菌液并加300 uL 50%甘油于甘油管 中，保存，每個菌保存3個甘油管。實驗三CTAB法提取植物內(nèi)生菌 DNA1. 實驗目的利用CTAB法提取植物內(nèi)生菌DNA，保存待測。2. 實驗原理十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)是一種陽離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多 聚糖的特性。在高離子強度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB與蛋白質(zhì) 和多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸。通過有機溶劑抽提，去除蛋白， 多糖，酚類等雜質(zhì)后

11、加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。3. 實驗材料(實驗分3批完成)1) 液氮；2) 研缽6個，干熱滅菌；3) CTAB DNA 提取液：a. 100 mM Tris-HCI (pH8.0)提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；b. 20 mM EDTA (pH8.0) 螯合 Mg2+ 或 Mn2+離子，抑制 DNase 活性；c. 1.4 M NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使 DNA蛋白復合物(DNP)充分溶解；d. 2 % (w/v) CTAB (cetyltrimethyl ammo nium bromide)溶解細胞膜，并結合核酸，使核酸便于分離；e. 1% PVP 40,000 (polyvin

12、yl pyrrolidone)(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡合 物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質(zhì)，有效去除多酚，減少 DNA中酚的 污染；同時它也能和多糖結合，有效去除多糖。將上述試劑混合后，滅菌20分鐘，常溫保存；4) 酚氯仿異戊醇 按照酚:氯仿:異戊醇=48:48:4的比例配置蛋白質(zhì)變性，同時 抑制了 DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA聯(lián)結鍵 已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚 相，而DNA溶于水相。使用酚的優(yōu)點：1.有效變性蛋白質(zhì)；2抑制了 DNase 的降解作用。缺點：1能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly（A）RNA 。

13、 2.不能完全抑制RNase的活性；5）氯仿異戊醇 按照氯仿：異戊醇=96:4的比例配置。能克服酚的缺點；加速有 機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚（酚易溶于氯 仿中）；6）異丙醇沉淀DNA ；7）70%的酒精清洗DNA ；8）2 mL與1.5 mL的離心管各18個，高溫濕熱滅菌。4. 實驗步驟1）收集大約100 mg的植物樣品，在使用前保存于-80 C 。2）將樣品放于研缽中，配合液氮，快速將樣品磨成粉末狀，將粉末盡量收集 于一個2 mL的離心管中。3）將步驟2中的離心管中加入0.9 mL CTAB，漩渦震蕩均勻，于65 C中水浴20-30分鐘 4） 水浴后，加入0.9

14、mL氯仿異戊醇，上下翻轉(zhuǎn)均勻，12000 rpm離心8分鐘。5） 將離心后上清液（510 L）轉(zhuǎn)至另一干凈的1.5 mL離心管中，加入340卩（上清液體積的2/3）異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)均勻（至有沉淀產(chǎn)生），12000 rpm 離心8分鐘。6）離心后棄掉液體，用0.7 mL 70 %的酒精清洗，12000 rpm離心2分鐘，小心地棄掉廢液，防止將DNA倒出7）重復步驟6。8）于通風櫥中將酒精晾干，至透明狀即可于-20 C、-80 C長期保存。5. 注意事項：1）實驗前應先預熱水浴鍋。3. 2）在對DNA質(zhì)量要求不是特別高的情況下，用氯仿異戊醇即可，不用酚氯 仿異戊醇。實驗四植物重金屬含量及土壤理化性質(zhì)測定1. 實驗目的回校后保存植物樣及土壤，待后續(xù)檢測。2. 實驗步驟在獲取根際土壤后，將取出的東南景天表面洗凈，晾干。測量鮮重后， 殺青，烘干。測量干重后，研磨，待測。植物重金屬含量， 3個重復，每 個重復0.1g，共需要植物根莖葉鮮重各 5g。內(nèi)生菌分離試驗后，取出土壤約 100g,風干，研磨，過20目篩，